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植物源蛋白肽吸收快、致敏性低、无副作用,且具有抗氧化、降血压、抗肿瘤等多种生物活性。已有研究表明,绿豆肽具有良好的免疫调节作用,但对绿豆肽的免疫作用是否与其分子量、结构存在相关性,尚不明确。本研究以绿豆肽(Mung bean protein hydrolysate,MBPH)为原料,巨噬细胞RAW264.7为模型,采用葡聚糖G-15凝胶柱进行分离纯化,测定其免疫活性,以筛选出免疫效果最佳的肽级分,分析其氨基酸组成、氨基酸序列,从而阐明绿豆生物活性肽的免疫调节作用机制。1、采用Sephadex G-15层析柱对绿豆肽进行分离纯化,获得三个级分(MBPH-1、MBPH-2、MBPH-3);将其作用于细胞后发现MBPH可促进巨噬细胞的正常生长,相比空白对照组其伪足长而多,但未达到LPS组过度激活的状态;MBPH可提高巨噬细胞增殖率以及吞噬能力,其中MBPH-3级分效果较为显著,其增殖率和吞噬能力吸光值分别为9.05%和0.588,相比空白对照组差异显著(P<0.05)。MBPH均可促进巨噬细胞细胞因子白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor,TNF-α)的表达,且在24 h时MBPH组表达量高于其它时间点的表达量,其中MBPH-3组最佳,分泌量分别为1634.30、598.89、852.13 pg/mL,相比空白对照组差异显著(P<0.05),且显著低于LPS组。MBPH还可显著抑制LPS诱导巨噬细胞细胞因子的分泌水平,且在12 h时抑制效果最佳,其中MBPH-3组效果显著优于其它级分,其IL-6、IL-1β和TNF-α的平均分泌量分别为2046.38、937.64、821.65 pg/mL,相比LPS组有一定的抑制效果,且差异显著(P<0.05)。以上研究结果表明绿豆肽的免疫活性与其分子量大小有一定的相关性。2、进一步对不同级分绿豆肽的免疫能力进行综合考察,结果表明,MBPH可促进巨噬细胞糖原和核酸含量的升高,以及巨噬细胞细胞因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)表达,其中MBPH-3级分绿豆肽促进效果最佳;同时不同级分绿豆肽又可抑制脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞分泌细胞因子,具有明显的抑制效果。不同级分绿豆肽可缓解由LPS造成的细胞凋亡,从而使G1、S、G2期细胞含量趋近正常水平,降低G1期细胞含量,提高S期、G2期细胞含量,从而使细胞恢正常周期水平,使巨噬细胞恢复正常增殖速率。MBPH组可促进核内p65蛋白的表达和I-κBα蛋白的激活,此外,MBPH可通过抑制p65和I-κBα蛋白的表达,缓解NF-κB通路的过度活化。3、采用质谱分析仪对MBPH-3结构进行分析,结果推测其肽段是由天冬氨酸(Asn)、天冬氨酸(Asn)、苏氨酸(Tyr)、甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Thr)、蛋氨酸(Met)组成的,其分子质量为903 Da;并采用氨基酸自动分析仪分析其游离氨基酸组成,发现其中含较高的疏水性氨基酸,并推测其免疫活性与疏水氨基酸含量有关。综上所述,MBPH具有一定的免疫调节作用,其效果的发挥与氨基酸的组成、分子量存在着一定的关系。