仿刺参(Apostichopus japonicus)是我国黄、渤海主要的经济类棘皮动物。当它遇到敌害生物伤害性刺激、攻击或不良自然环境影响时,会表现出特殊的防御行为——“吐脏”,即将大部分消化道及与之相连的组织器官(呼吸树、性腺等)泄出,在适宜时再生出一套内脏。然而,如果环境条件持续恶劣、或者是幼参发生吐脏,往往引起大量死亡,给水产业造成巨大损失。海参类的这种特殊的再生特征,也引起了医学界再生医学研究领域的关注。关于再生的分子调控机制研究,已经有一些报道,但有关MEGF6、KLF13和BTF3L4对仿刺参再生过程的调控机制,目前还未见报道。MEGF6为多功能表皮生长因子,含有和表皮生长因子(EGF)相近的结构和功能特征,往往有30余个EGF样结构域。MEGF6在促进胚胎发育、维持机体内环境稳态方面起关键作用,表现在调控细胞生长、迁移等。KLF13为基础转录因子,广泛分布于生物细胞中,其C端为DNA结合域,有3个保守的Cys2/His2(C2H2)锌指结构。KLF13通过锌指结构结合靶基因启动子、增强子区富含CACCC盒或GC盒的DNA序列,以此激活转录表达,发挥调控细胞增殖、分化、周期进程等作用。BTF3为基础转录因子,具有典型的NAC结构域,BTF3普遍存在于多种动、植物及微生物中,具有双重身份:?属于基本转录因子,与RNA聚合酶II结合,参与调控基因转录;?属于NAC家族,通过与蛋白结合防止错误折叠,调节蛋白合成与降解。本文以仿刺参为实验材料,利用高通量测序技术(BGISEQ-500平台)构建了仿刺参肠再生5d、10d的转录组;采用RACE技术克隆了Aj-megf6、klf13、btf3l4的基因全长;采用IF技术确定了Aj-MEGF6、KLF13和BTF3L4的亚细胞定位;采用q PCR法分析了Aj-megf6、klf13、btf3l4以及egfr、wnt6基因m RNA在肠再生过程中的表达模式;利用WB技术分析了Aj-MEGF6、KLF13和BTF3L4以及通路相关作用蛋白(EGFR、SNAI2、CDH1、CREB1、CDK2、Cyclin D1、WNT6、BMI1)在肠再生过程中的表达变化,并研究了调控机制。Aj-MEGF6、KLF13和BTF3L4在肠再生过程中的调控机制研究对探索仿刺参再生机理具有较为重要的理论意义,对预防或避免仿刺参苗种培育、养成过程中因吐脏而造成死亡或减产具有潜在的应用价值。本研究的实验结果如下:1、获得对照组、再生5d组、再生10d组的Clean Reads分别为43811752条、42987312条、43507122条,与基因组、基因集的平均比对率分别为44.35%、28.36%;共检测到表达的基因为27766个。相比对照组,再生5d组有5255个基因上调,3849个基因下调;再生10d组有4179个上调,4780个下调。在再生5d、10d组中,megf6、klf13、btf3l4均显著上调。2、Aj-megf6基因c DNA全长是5665bp,编码1604个氨基酸,含37个EGF样的结构域;预测Aj-MEGF6相对分子量为172.5k Da;有信号肽,是分泌蛋白;为亲水性、非跨膜蛋白;有53个磷酸化位点;亚细胞定位预测该蛋白52.2%在细胞核,17.4%在线粒体,8.7%在细胞膜,8.7%在细胞质,4.3%在分泌系统囊泡,4.3%在高尔基体,4.3%在细胞外。通过MEGF6氨基酸多序列比对,发现仿刺参与其它18种生物的序列相似性为38.59～49.07%,其中与紫球海胆的最相似;NJ系统进化树表明,仿刺参与紫球海胆、长棘海星聚为一支,该结果符合仿刺参的分类及进化地位。Aj-klf13基因c DNA全长是2496bp,编码284个氨基酸,含3个C2H2锌指结构域;预测Aj-KLF13蛋白相对分子量为32.5k Da;该蛋白无信号肽,不是分泌蛋白;为亲水性、非跨膜蛋白;有26个磷酸化位点;亚细胞定位预测该蛋白95.7%在细胞核,4.3%在液泡。通过KLF13氨基酸序列比对,发现仿刺参与其它19种生物的序列相似性为35.64～49.83%,其中与紫球海胆的最相似;NJ系统进化树表明,仿刺参与紫球海胆、长棘海星聚为一支。Aj-btf3l4基因c DNA全长是1099bp,编码161个氨基酸,有NAC结构域;预测Aj-BTF3L4相对分子量为17.9k Da;该蛋白无信号肽,不是分泌蛋白;为亲水性、非跨膜蛋白;有5个磷酸化位点;亚细胞定位预测该蛋白56.5%在细胞核,26.1%在线粒体,13.0%在细胞质,4.3%在囊泡分泌系统。通过BTF3L4氨基酸序列比对,发现仿刺参与其它14种生物的序列相似性为54.55～58.43%,其中与紫球海胆的最相似;NJ系统进化树表明,仿刺参与紫球海胆聚为一支。3、在肠再生过程中,Aj-megf6、klf13、btf3l4、egfr和wnt6基因m RNA水平的表达模式相似,即先升高再下降。从3d开始上升,6～12d时到达峰值(分别为对照组水平的126.47、53.36、4.19、5.32、8.32倍),15～21d时下调至对照组水平。4、通过IF的亚细胞定位结果显示,Aj-MEGF6主要分布在细胞质和细胞外,与生物信息学预测的结果(主要在细胞核)是不同的;Aj-KLF13、BTF3L4主要在细胞核,和生物信息学预测的相同。5、Aj-MEGF6、KLF13、BTF3L4、EGFR、WNT6蛋白的表达模式与基因m RNA的相似,即为先升高再下降的趋势。从3d开始上升,6～12d时到达峰值(分别为对照组水平的9.32、1.64、1.26、3.89、3.59倍),15～21d时下调至对照组水平。相关作用蛋白SNAI2、CREB1、CDK2、Cyclin D1、BMI1在肠再生过程中的表达模式与Aj-MEGF6、KLF13、BTF3L4基本一致,分别在6～12d时到达峰值,然后逐渐下调;而CDH1的变化趋势与之相反,即呈先下降再升高,在6d时达最低点。6、MEGF6是ECM的主要成分之一,能调控维持组织的完整性。仿刺参肠再生过程中MEGF6、EGFR高表达,促进二者结合,通过Tgfβ/Smad信号途径介导来上调SNAI2。SNAI2可诱导Cyclin D1高表达;WNT6高表达,在激酶参与下,也可引起Cyclin D1上调表达,有助细胞增殖。而KLF13是Cyclin D1启动子的有效激活因子,且激活过程可以被GATA4增强,促进Cyclin D1转录表达。同时,CREB可与Cyclin D1中的CRE序列结合,促进基因转录,上调Cyclin D1基因表达。CDKs可与Cyclin结合成异二聚体,以其活性催化底物磷酸化,促进细胞周期进行。同时SNAI家族也是CDH1的抑制因子之一,当SNAI2高表达,CDH1受到抑制后,会诱导EMT,促进细胞增殖及转移。BTF3作为BMI1的上游,其高表达可抑制BMI1的泛素化降解,而BMI1作为可以控制胚胎干细胞多能性和早期胚胎发育的关键调节因子,可介导Wnt等通路,同样促进EMT,调控细胞更新。而间充质细胞的自我更新和多向分化潜能,是发育、伤口愈合的基础。仿刺参肠系膜增厚处的这种细胞为肠腔上皮再生提供了细胞来源,细胞再经分裂、增殖实现仿刺参肠组织的再生重建。