论文部分内容阅读
丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-acivated protein kinase,MAPK)是一种高度保守的丝氨酸／苏氨酸激酶，可被多种刺激因子活化，是细胞内的重要信号传递者。在哺乳动物细胞中，当前研究核心是三条平行的MAPK途径：ERK(extracellular Signal-regulated kinase)途径、JNK(c-jun N-terminal kinase)途径和P38途径。在不同的外界因子刺激下，不同类型的细胞可能选择不同的信号途径，产生不同的生理应答。 佛波酯(12-o-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate,TPA)是一种生长因子，与细胞生长，分化，凋亡及细胞周期停滞密切相关。TPA是蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的激活剂，激活PKC后能够调控细胞生命活动。全反式视黄酸(all-trahs retinoic acid,ATRA)是一类维生素A衍生物，主要通过以下几个方面发挥作用：1 抑制细胞增殖；2 诱导细胞分化：3 诱导细胞凋亡；4 免疫调节；5 抑制血管形成；6 影响癌基因或抑癌基因的表达。在某些类型的肿瘤细胞中，TPA与ATRA之间可能存在协同作用，而在另一些类型的肿瘤细胞中，ATRA可以有效拮抗TPA的作用。 本文工作以胃癌细胞BGC-823为材料，运用分子细胞生物学手段，研究TPA／ATRA对胃癌细胞MAPK信号转导途径中一些激酶的调节作用，以及对细胞周期调控因子的调节作用。为进一步了解胃癌发生及发展的可能机制提供理论依据。 首先，用MTT法检测TPA／RA对BGC-823细胞生长的作用，发现TPA和ATRA均有效地抑制BGC-823细胞生长，且具有浓度依赖性，说明TPA从TRA在BGC-823的生长抑制中存在着协同作用。进一步检测TPA／ATRA对细胞周期分布的影响，发现大量细胞滞留在G0／G1期，共同处理时，阻断效应也相应增强，表明TPA／ATRA对胃癌细胞生长的抑制作用与细胞滞留在G0／G1期有关。为此，采用western blot法检测TPA／ATRA对一些重要的G1／S期调控蛋白表达水平的影响。结果表明：cyclinD1与CDK2稳定表达，不被调控；TPA／ATRA处理时，cyclinE和磷酸化的RB蛋白水平呈下调趋势，共同作用时，基本抑制 Cycl mE的表达，但对 pRb抑制的协同作用不明显；TPA以时间依赖方式上调P21wafl 和P53的蛋白表达，与ATRA共同处理时，上调趋势增强．表明TPA八TRA可以通过调节细胞周期调控分子的蛋白表达水平，抑制 cyclin｛DK激酶活性，使Rb蛋白去磷酸化，诱导细胞滞留在GO／GI期，从而抑制细胞的生长． 其次，我们前期研究结果发现，BGC1 2 3细胞经 TPA处理后发生凋亡，呈现典型的凋亡形态变化。本文进一步检测JNK蛋白表达，TPA处理后，JNK水平迅速上升，3h时达到最高峰，其后略有下降，但蛋白表达水平始终高于对于对照组．检测 c刁un mRNA的表达，观察到类似的现象．瞬时转染和 CAT a s s ay检测，观察到 TPA以剂量依赖的方式上调AP＜蛋白的转录活性．用PKC抑制剂wortamanin预处理细胞后，TPA诱导的JNK的蛋白表达量低于TPA单独处理组，细胞凋亡数量也同样远远低于TPA单独处理组，说明TPA通过PKC途径激活JNK。以上结果不仅证实TPA诱导的凋亡与通过PKC途径激活的州K相关，而且显示BGC亿n细胞中JNK途径对于TPA诱导的细胞凋亡是必需的． 通过检测 TPA八TRA作用下 P38和上游激酶Mc习的蛋白表达水平，发现PA以时间依赖的方式抑制两种激酶的蛋白表达水平，用特异性抑制剂SB2m190阻断P38途径，检测细胞周期调控分子P21wafl和CyclinE蛋白表达水平，观察到ATRA诱导的P21wafl蛋白表达水平下降，而CyclinE则呈现上调趋势，进一步证明P38途径在ATRA调节胃癌细胞周期调控因子的表达中具有重要的调节作用，从而引起细胞周期停滞，抑制胃癌细胞的生长． 最后，我们还检测了TPA八TRA对ERK途径的调节作用，观察到ERK的蛋白水平基本不变；TPA先是以时问依赖方式上调p卫RK，24h达到最高峰，随之下降，48h时蛋白表达水平则低于对照组。ATRA则抑制P－ERK蛋白的表达，TPA八TRA共同处理时抑制作用明显加强．同时 TP＾以时间依赖的方式诱导Ras蛋白，ATRA处理和TP＊从A处理时不能诱导Ms的表达．抑制剂PD98“9阻断矾K途径时，可以显著下调wA和ATRA诱导的P21wafl的表达．因此证明皿K途径参与TPVATRA对邵C－823细胞周期和细胞生长过程的调控． 综上所述，本论文工作表明，TPA一方面激活JNK途径，诱导转录因子AP刁的转录活性，启动一系列凋亡相关基因的表达；诱导细胞发生凋亡；另一方面通过ERK途径将生长抑制信号传递至细胞中，通过调控细胞周期相关因子的表达，使Rb蛋白去磷酸化而导致细胞滞留在GO／GI期，从而抑制胃癌细胞生长；ATRA则主要通过ERK和P38途径传递生长抑制信号，产生与TPA的抑制作用类似的效应来抑制胃癌细胞的恶性生长．