论文部分内容阅读
细胞因子(cytokine)是一类由免疫细胞分泌后调节细胞功能的小分子多肽,它们在细胞的生长和分化等过程中发挥重要的作用。白细胞介素10(interleukin10, IL-10)是其中一个典型的代表,它是由多种细胞所分泌的因子,在调节免疫功能和炎症反应中起作用。目前国内外研究还主要集中于人IL-10基因启动子多态与疾病的关联性方面,对家兔IL-10基因外显子多态及该基因亚细胞定位等方面的研究鲜有报道。因此本研究以新西兰白兔为实验对象,对其IL-10基因编码区进行克隆和生物信息学分析；构建原核表达载体并进-步诱导蛋白表达以制备多克隆抗体,构建真核表达载体研究该基因在DF-1细胞中的定位；以新西兰白兔、福建黄兔为研究对象,利用PCR-SSCP法检测该基因5个外显子的多态性。试验主要研究内容及结果如下：1.IL-10基因的克隆及生物信息学分析。利用RT-PCR技术从新西兰白兔脾脏总RNA中扩增出IL-10基因的CDS序列,并将其克隆至pMD19-T Simple载体中。菌液PCR、酶切及测序结果均表明pMD19-T-IL-10载体构建正确。分析兔IL-10基因,发现其cDNA全长为1,227bp, CDS编码区长537bp,共编码178个氨基酸残基,且第75至95位氨基酸之间存在1个功能位点。该蛋白分子质量约为20.15kDa,理论等电点pI为8.20,该蛋白是不稳定的脂溶性蛋白,在前21个氨基酸的位置存在信号肽,且不含有跨膜结构,存在多个潜在的磷酸化位点。此外,该蛋白二级结构中只含有α螺旋和自由卷曲。同源性分析和进化树分析表明,家兔IL-10与哺乳动物亲缘关系较近,而与禽类和鱼类亲缘关系较远。2.IL-10基因外显子多态性及其与血清IL-10指标的关联性分析。PCR-SSCP结果表明,该基因第1、2、4和5外显子均不存在多态,外显子3中检测到3种基因型(AA,BB和AB),1个SNP位点(A2150G),且该突变为同义突变不造成编码的氨基酸的改变。血清中IL-10指标检测发现,新西兰白兔群体IL-10水平显著高于福建黄兔,且2个群体中不同基因型个体间IL-10水平差异不显著。3.1L-10基因的原核表达及抗体制备。将克隆得到的IL-10基因亚克隆至原核表达载体pET-32a,然后转化入表达菌株BL21(DE3),利用IPTG成功诱导了IL-10基因的高效表达,SDS-PAGE电泳检测融合蛋白大小为37.7kDa,且主要以包涵体形式存在。将获得的融合蛋白纯化后作为抗原免疫2只健康豚鼠,并以此制备了多克隆抗体。ELISA检测抗体效价高达1：56,000,Western blot检测抗体特异性强,为进一步探讨重组IL-10的生物学功能及其在疫病中的作用奠定了基础。4.IL-10基因的真核表达及亚细胞定位。将克隆得到的IL-10基因亚克隆至真核表达载体pEGFP-C1,脂质体介导融合表达载体pEGFP-IL-10瞬时转染DF-1细胞,48h后在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光在细胞中的位置,发现融合蛋白分布在细胞质内；同时提取细胞总RNA与总蛋白,在mRNA及蛋白水平上均检测外源基因的表达,且融合蛋白大小69.6kDa,为深入研究IL-10基因的生物学功能奠定基础。