第一部分:脱细胞骨软骨基质支架的制备及相关研究目的:制备多种兔脱细胞骨软骨支架,并对这些支架进行脱细胞效果、成份、结构与生物力学测试等研究,为组织工程构造骨软骨复合物建立基础。方法:利用物理、化学、酶类联合脱细胞方法,对兔股骨滑车关节和肋骨软骨整体进行脱细胞处理,获得整体骨软骨支架,将兔股骨滑车关节和肋两个部位骨软骨按照透明软骨、钙化软骨层、软骨下骨三层结构进行分离粉碎,对三层微粒进行脱细胞处理,重新交联制备关节和肋来源的分层骨软骨支架。对整体骨软骨支架进行组织学染色,荧光比色法对整体支架各分层微粒进行残留DNA含量测定,验证脱细胞程度。利用氨基酸分析仪和荧光比色法对三层微粒中氨基酸和糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAG)进行定量分析,XRD衍射仪对羟基磷灰石进行定量分析,并与天然骨软骨进行对比。检测三种支架密度、孔隙率、孔径、吸水率等物理参数,拉扭复合力学测试机检测三种支架在干燥、湿润状态下的弹性极限、强度极限、弹性模量、脆性等力学机械性能,并和天然骨软骨进行对比。结果:本方法脱细胞程度较为彻底。相比天然骨软骨组织,脱细胞过程损失了约20~30%的氨基酸,损失了30~40%的GAG,但无机物并无损失。相比整体支架,分层支架的密度较小,孔隙率、孔径、吸水率更大。相比天然骨软骨组织,无论干燥或湿润状态,两种支架机械性能均差,且分层支架差距更大。结论:本研究联合脱细胞效果较为彻底,但有机成分有所损失。脱细胞整体支架与分层支架相比天然组织,机械性能均有不同程度下降,提示结构(尤其超微结构)和成份的完整性对生物力学性能影响至关重要。第二部分:脱细胞骨软骨支架负载兔IPFP-SC的相关体外研究目的:分离提取兔髌下脂肪垫间充质干细胞(IPFP-SC)并对之鉴定,检测骨软骨支架的生物相容性、细胞毒性,研究骨软骨基质成份、结构对IPFP-SC向成骨、成软骨分化的影响。初步探讨利用脱细胞基质进行生物3D打印。方法:利用胶原酶消化法和贴壁培养法分离提取出IPFP-SC,根据细胞表面分子流式细胞分析(FACS)、免疫荧光(IF)鉴定表型,检测其成骨、成软骨、成脂分化能力。制作兔膝OA模型,比较健康与OA兔IPFP-SC在增殖、迁移、成软骨方面的区别。利用直接接种法、直接植入法、浸提液培养法验证多种脱细胞骨软骨支架的生物相容性与细胞毒性。检测支架骨、软骨的仿生结构和骨、软骨组织成份对IPFP-SC向成骨、成软骨方向诱导的作用。利用Micro-CT扫描和天狼星染色连续切面图像数字化方式,获得兔天然骨软骨的结构数据,制作STL格式文件,对利用脱细胞基质生物3D打印进行初步探讨。结果:所提取细胞,FACS及IF验证表达CD73+、CD90+、CD105+、CD 44+、CD34-、CD45-、HLADR-,可向成骨、成软骨、成脂分化。OA个体IPFP-SC相比健康个体,在增殖方面无显著差别,迁移及成软骨能力较弱。三种脱细胞支架生物相容性良好,无细胞毒性。骨软骨的结构、成份均可促进IPFP-SC向成骨、成软骨方向分化。得到的骨软骨结构STL文件可以较好的模拟打印出天然组织。结论:所提取细胞证实为间充质干细胞,OA个体IPFP-SC迁移及成软骨能力较弱可能是影响软骨修复的原因。脱细胞支架的仿生结构和组成成份均影响着IPFP-SC向成骨、成软骨分化,这为IPFP-SC体内诱导为目的细胞打下了基础第三部分:脱细胞骨软骨支架负载兔IPFP-SC修复兔骨软骨缺损目的:通过将负载IPFP-SC的三种脱细胞骨软骨支架复合体植入兔股骨滑车骨软骨缺损模型中,研究三种组织工程方法修复骨软骨缺损的效果。方法:制作42例标准兔股骨滑车关节骨软骨缺损模型。分别将脱细胞关节整体骨软骨支架、脱细胞关节分层骨软骨支架、脱细胞肋分层骨软骨支架三种支架分为3组,组内分为负载或不负载IPFP-SC的亚组,除空白组共6小组,随机分配植入骨缺损模型中。术后1个月、3个月、6个月处死实验兔取得标本,大体观察修复组织的软骨面及软骨下骨面,石蜡切片进行HE、天狼猩红、番红固绿、甲苯胺蓝染色,比较各种组织工程方法修复骨软骨损伤的效果。结果:总体修复效果,负载IPFP-SC组优于单纯支架组,空白组最差,软骨修复方面,分层支架组优于整体支架组,软骨下骨修复方面则相反。1月时,除空白组外,各组间差异不大,3月、6月时,包括空白组,各组差异最明显。结论:三种组织工程构造方式对骨软骨缺损均能起到一定的修复作用,其中分层支架修复软骨能力较强,整体支架修复软骨下骨能力较强。