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研究背景:
银屑病是一种以表皮过度增殖为主要病理特征的慢性炎症性皮肤病。临床特点为境界清楚的覆有鳞屑的红斑,银屑病斑块的病理改变主要在表皮层,表现为角质形成细胞过度增生,角化不全。然而,早在20年前,就有研究人员指出,银屑病累及的是皮肤全层,而并非只是角质形成细胞。已有研究表明,在银屑病皮损区和非皮损区成纤维细胞的刺激下,正常表皮会处于过度增生状态。那么,银屑病皮肤功能缺失的深层原因是否在于成纤维细胞?
转化生长因子β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)是多功能细胞因子超家族成员之一,在调节细胞增殖和分化、迁移,细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)蛋白合成中起重要作用。众多研究表明,银屑病患者的皮损及血清中TGF-β1表达水平存在异常。既往对TGF-β1参与银屑病发病机制的研究,多集中于TGF-β1对角质形成细胞的抑制作用,我们则认为,TGF-β1还可以显著激活银屑病皮损成纤维细胞,刺激成纤维细胞分泌和细胞外基质蛋白(ECM)的合成。TGF-β1诱导的银屑病真皮中异常的成纤维细胞可能是银屑病发病的始动因素之一。
目的:
明确TGF-β1对银屑病皮损区成纤维细胞和正常人皮肤成纤维细胞诱导细胞外基质蛋白CCN2,FN,typeⅠ collagen及间充质蛋白N-cadherin、Vimentin、β-catenin的表达的作用,重点研究不同调控因子(ALK5通路抑制剂与ERK1/2通路抑制剂)对TGF-β1诱导银屑病及正常人真皮成纤维细胞表达ECM及Smad1,Smad2,ERK1/2磷酸化的影响,探究其涉及的细胞通路。
方法:
活检皮肤,分离、培养银屑病皮损区及正常真皮成纤维细胞,提取总蛋白质。以Western Blot法检测TGF-β1诱导成纤维细胞表达CCN2,ECM蛋白(FN、typeⅠ collagen)及间充质蛋白N-cadherin、Vimentin、β-catenin的作用,及磷酸化蛋白p-Smad1,p-Smad2,p-ERK1/2表达的作用,以ALK5通路抑制剂SB431542和ERK1/2通路抑制剂U0126阻断相应细胞通路,了解影响银屑病成纤维细胞中TGF-β1诱导CCN2及ECM蛋白表达的可能机制。
结果:
一.TGF-β1对正常人及银屑病成纤维细胞表达CCN2、及FN、typeⅠ collagen等ECM蛋白的影响。
1.正常人及银屑病成纤维细胞中,在TGF-β1的作用下,CCN2的表达显著增加;
2.正常人及银屑病成纤维细胞中,在TGF-β1的作用下,ECM蛋白(Fibronectin,typeⅠ collagen)表达显著增加。
3.在TGF-β1的作用下,正常人及银屑病成纤维细胞间充质蛋白N-cadherin、Vimentin、β-catenin的表达显著增加。
二.TGF-β1对正常人及银屑病成纤维细胞中TGF-β/Smads通路中Smads蛋白及MAPK通路中ERK1/2蛋白的磷酸化的影响。
1.在正常人及银屑病成纤维细胞中,TGF-β1的作用下,TGF-β/Smads通路中Smads蛋白的磷酸化增加,即磷酸化蛋白p-Smad1,p-Smad2的显著表达增加。
2.在TGF-β1的作用下,正常人及银屑病成纤维细胞中MAPK通路中ERK1/2蛋白的磷酸化增强,即磷酸化蛋白p-ERK1/2表达显著增加。
三.ALK5通路抑制剂SB431542对TGF-β1诱导正常人与银屑病成纤维细胞表达CCN2、FN、typeⅠ collagen、N-cadherin、Vimentin、β-catenin蛋白的影响。
1.加入ALK5通路抑制剂SB431542作用后,正常人与银屑病成纤维细胞表达CCN2,FN,typeⅠ collagen显著降低。
2.加入ALK5通路抑制剂后,正常人与银屑病成纤维细胞表达N-cadherin、β-catenin显著减少,但Vimentin的表达无明显变化。
四.ERK1/2通路抑制剂U0126对TGF-β1诱导正常人与银屑病成纤维细胞表达CCN2、FN、typeⅠ collagen、 N-cadherin、 Vimentin、β-catenin蛋白的影响。
1.在正常人与银屑病成纤维细胞中,加入ERK1/2通路抑制剂U0126后,CCN2,FN,typeⅠ collagen的表达略微降低,但无统计学意义。
2.在正常人与银屑病成纤维细胞中,加入ERK1/2通路抑制剂U0126后,Vimentin的表达显著下降,差异有统计学意义;而N-cadherin、β-catenin的表达略微降低,差异无统计学意义。
五.ALK5通路抑制剂SB431542和ERK1/2通路抑制剂U0126对TGF-β1诱导Smads蛋白及ERK1/2磷酸化的影响
1.TGF-β1可以显著诱导p-Smad1,p-Smad2,p-ERK1/2表达显著增加,在正常人及银屑病成纤维细胞中,使用SB431542阻断ALK5通路后,磷酸化蛋白p-Smad1,p-Smad2的表达明显降低;SB431542对p-ERK1/2的表达的无明显影响。
2.相反地,使用U0126阻断ERK1/2通路对p-Smad1,p-Smad2的表达无影响,但U0126显著降低TGF-β1诱导的p-ERK1/2的表达。
结论:
1.TGF-β1可以显著诱导正常人及银屑病成纤维细胞CCN2,FN,typeⅠ collagen表达的增加,差异具有统计学意义。
2.TGF-β1可以显著诱导正常人及银屑病成纤维细胞表达间充质蛋白N-cadherin、Vimentin、β-catenin增加。
3.TGF-β1可以激活正常人及银屑病成纤维细胞中的TGF-β/Smads通路,促使磷酸化蛋白p-Smad1,p-Smad2的表达增加。
4.TGF-β1可以激活正常人及银屑病成纤维细胞中的MAPK通路中ERK1/2通路,使磷酸化蛋白p-ERK1/2的表达增加。
5.ALK5通路抑制剂SB431542显著抑制TGF-β1诱导的CCN2等ECM蛋白的表达,而ERK1/2通路抑制剂U0126虽然能使ECM蛋白的表达略微下降,但无统计学意义。
6.SB431542显著抑制TGF-β1诱导的磷酸化蛋白p-Smad1,p-Smad2的表达,而U0126则作用不明显。
7.U0126显著抑制TGF-β1诱导p-ERK1/2的表达,而SB431542则无明显作用。8.银屑病成纤维细胞表达CCN2、 Fibronectin、typeⅠ collagen、 N-cadherin、Vimentin、β-catenin比正常人成纤维细胞增高,但差异不明显,无统计学意义。
9.ALK5通路在TGF-β1诱导正常人及银屑病成纤维细胞表达CCN2、Fibronectin、typeⅠ collagen、N-cadherin、β-catenin中发挥重要作用。
10.ERK1/2通路在TGF-β1诱导正常人及银屑病成纤维细胞表达Vimentin中发挥重要作用;在CCN2、Fibronectin、 typeⅠ collagen、N-cadherin、β-catenin中表达中作用不明显。