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脓毒症的发病率和死亡率较高,神经系统是脓毒症时最早累及的器官。脓毒症脑病又称脓毒症相关性脑病(Sepsis-associated encephalopathy SAE)是脓毒症引起的弥漫性脑功能障碍。SAE的发病率为8%-70%,是ICU中最常见的脑病。并发SAE使脓毒症患者的死亡率明显增高。SAE病理生理机制较复杂,尚不明确,目前研究表明可能包括脑微血管内皮细胞功能障碍,血脑屏障(BBB)的破坏,脑局部炎症细胞的浸润,炎症介质的参与,脑灌注的下降,脑微血管调节障碍,星形胶质细胞和神经元功能障碍,神经递质紊乱,线粒体功能障碍,细胞凋亡,氧化应激和钙失调等。由此可见,SAE有多种病理生理机制参与,目前缺乏针对其病理生理机制的治疗和预防手段。有研究证实SAE时存在线粒体功能障碍,脓毒症除了破坏线粒体膜电位,影响线粒体呼吸链功能,引起神经细胞能量供应不足,还介导神经细胞凋亡。现大量研究表明Omi/HtrA2是一种寡聚丝氨酸蛋白酶,在多种病理情况(心脏缺血/再灌注损伤,顺铂引起的肾损伤,脑缺血/再灌注损伤等)下介导细胞凋亡起关键作用,并且多项研究证实Omi/HtrA2参与多种神经系统疾病的病理过程(如亨廷顿氏病,脑缺血/再灌注及癫痫持续状态等)。本研究通过建立SAE大鼠模型,研究SAE大鼠海马组织氧化应激损伤及神经细胞凋亡,研究SAE对Omi/HtrA2信号通路(Omi/HtrA2线粒体内外表达及XIAP.caspase-3,9裂解产物、蛋白酶PARP裂解产物的胞浆内表达)的影响及应用Omi/HtrA2蛋白酶特异性抑制剂,Ucf-101对SAE干预,由此深入研究Omi/HtrA2信号通路介导SAE的作用及机制,为SAE提供新的治疗靶点。第一部分脓毒症脑病模型的建立目的：脓毒症相关性脑病(SAE)是ICU中最常见的脑病,使得脓毒症患者的死亡率明显增高,目前病理生理机制尚不明确,缺乏客观的诊断指标及有效的治疗和预防手段,迫切需要大量动物基础研究。本部分选用金标准模型——盲肠结扎穿刺法(CLP)建立脓毒症模型,并通过评估大鼠行为学试验及神经反射评分,结合海马病理学改变,确定脓毒症脑病模型成功建立,以便于下一步实验研究。方法：取SD大鼠,建立CLP模型,用4%水合氯醛(1ml/100g)腹腔注射麻醉,腹部剃毛并用碘伏消毒,铺巾,沿腹中线剪开2cm腹部切口,暴露盲肠,在回盲瓣远端结扎盲肠,然后用18号针刺穿刺盲肠一次,轻轻挤压盲肠,使少量的肠内容物渗出,然后将盲肠返回到腹腔,关闭腹腔。假手术组(sham)大鼠予剖腹,并将盲肠外置1分钟,不予盲肠穿刺或结扎,然后将盲肠回纳至腹腔并关腹。每只手术操作的大鼠术后每6小时给予皮下注射生理盐水(3ml/100g)及头孢曲松(30mg/kg)。实验于麻醉后直视下行股动脉切开置入24G输液管以测定血压、心率。记录术前、术后6h、12h和24h血压、心率和肛温,并在以上时间点经股动脉采血1ml测血乳酸水平(每个时间点,n=3)。术后24小时,处死大鼠,取大鼠海马组织行苏木素-伊红(hematoxylin and eosin, H&E)染色观察脓毒症海马病理学改变(n=6)。另外相同分组(n=16),术后每天给予皮下注射生理盐水及头孢曲松,并允许正常进食及饮水,我们观察了实验大鼠7d生存率及大鼠体重的变化,行神经反射评分、新物体认知试验及Morris水迷宫试验行为学评估。结果：CLP组大鼠出现蜷缩少动、竖毛,个别大鼠出现偏瘫、癫痫发作表现；并出现平均动脉压明显下降,心率明显升高,血乳酸水平增高；体重明显下降；CLP组大鼠存活率明显下降,第3天为43.75%,第4-7天为37.5%；CLP组大鼠24h神经反射评分明显下降,并在第4天、第7天已逐渐恢复；海马H&E染色病理学检查提示CLP组大鼠可见明显神经元固缩、深染,细胞结构不清,细胞周围空隙明显增大,胶质细胞周围间隙扩大,空泡样改变,血管周围间隙扩大,以海马齿状回(dentate gyrus, DG)区最为显著,CA3区最轻。行为学试验(Morris水迷宫试验及新物体认知试验)均提示CLP大鼠学习记忆功能受损。结论：CLP组大鼠完全模拟了脓毒症典型临床表现,神经反射评分及行为学检查提示大鼠脓毒症相关性脑病(SAE)模型制作成功,为后续SAE机制研究做好基础。海马组织病理改变提示海马损伤可能与SAE的发生有关。第二部分Omi/HtrA2蛋白酶特异性抑制剂ucf-101对脓毒症脑病的保护作用目的：大量研究提示SAE与海马神经细胞凋亡相关,而Omi/HtrA2是介导细胞凋亡的关键促凋亡蛋白,研究表明Omi/HtrA2蛋白酶特异性抑制剂ucf-101在多种病理情况下能抑制细胞凋亡,改善神经功能。本研究观察ucf-101对大鼠SAE的神经保护作用。方法：实验动物随机分为四组,分别为假手术组(Sham)、假手术+Ucf-101组(Sham+Ucf-101)、CLP组(CLP)、CLP+Ucf-101组。每只手术操作的大鼠术后每6小时给予皮下注射生理盐水(3ml/100g)及头孢曲松(30mg/kg)。手术操作前30分钟、术后每日腹腔注射Ucf-101(10umol/kg)或生理盐水(10mL/kg)。实验24小时处死大鼠,取大鼠海马组织检测神经细胞的凋亡情况及病理学改变(n=6),检测海马组织氧化应激指标,包括谷胱甘肽(GSH),丙二醛(MDA),髓过氧化物酶(MPO)的含量及过氧化氢酶(CAT)的活性,检测海马组织炎症因子肿瘤坏死因子(TNF)-α及白介素(IL)-6水平(n=6)。另外相同分组(n=16),术后每天给予皮下注射生理盐水及头孢曲松,术后每日腹腔注射Ucf-101或生理盐水,并允许正常进食及饮水,我们观察了实验大鼠7d生存率及大鼠体重的变化,行神经反射评分、新物体认知试验及Morris水迷宫试验行为学评估。结果：CLP组大鼠存活率明显下降,24h神经反射评分明显下降,学习记忆功能损害(行为学试验),Ucf-101台疗能明显提高大鼠生存率,明显提高大鼠术后24h神经反射评分,明显改善大鼠的学习记忆功能。CLP组大鼠海马区可见明显神经元固缩、深染,细胞结构不清及大量细胞凋亡,Ucf-101治疗能明显改善CLP导致的海马区病理损害及细胞凋亡。CLP组大鼠海马区TNF-α、IL-6水平明显升高,存在明显氧化应激损伤(MDA水平及MPO浓度明显增高,GSH水平和CAT活性明显下降),Ucf-101疗能明显改善海马区炎症反应,减轻氧化应激损伤。结论：脓毒症可引起大鼠海马区炎症、氧化应激损害及细胞凋亡,导致大鼠认知记忆功能障碍,这提示脓毒症脑病发病与海马区神经细胞受损有关。Omi/HtrA2蛋白酶特异性抑制剂Ucf-101能明显减少海马区神经细胞凋亡,改善炎症和氧化应激损害,保护大鼠认知记忆功能。因此推测Ucf-101对SAE有神经保护作用,Omi/HtrA2可能是SAE治疗的新靶点。第三部分Omi/HtrA2信号通路介导脓毒症脑病的机制研究目的：Omi/HtrA2参与多种神经系统疾病的病理过程,本研究旨在观察SAE时Omi/HtrA2信号通路(Omi/HtrA2线粒体内外表达及XIAP、caspase-3、9裂解产物、蛋白酶PARP裂解产物胞浆内表达)的改变,并观察Ucf-101干预对Omi/HtrA2信号通路的影响,由此深入研究Omi/HtrA2信号通路介导SAE的作用及机制。方法：实验动物随机分为四组(n=6),分别为假手术组(Sham)、假手术+Ucf-101组(Sham+Ucf-101)、CLP组(CLP)、CLP+Ucf-101组。手术操作前30分钟腹腔注射Ucf-101(10umol/kg)或生理盐水(10mL/kg)。每只手术操作的大鼠术后每6小时给予皮下注射生理盐水(3ml/100g)及头孢曲松(30mg/kg)。24小时处死大鼠,取大鼠海马组织,并分离线粒体和胞浆,用Western blot法分别检测Omi/HtrA2线粒体及胞浆中表达,并检测胞浆中XIAP、Caspase-3.9裂解产物、蛋白酶PARP裂解产物和cytochrome c表达。结果：CLP组Omi/HtrA2从线粒体向胞浆内转移,胞浆内Omi/HtrA2蛋白表达明显升高,胞浆内XIAP表达明显下调,Caspase-3、9裂解产物及蛋白酶PARP裂解产物表达明显升高,Ucf-101处理可抑制Omi/HtrA2的转移,阻止XIAP的降解；明显减少胞浆内Caspase-3、9裂解产物及蛋白酶PARP裂解产物的表达；本研究也发现CLP组cytochrome c从线粒体释放至胞浆,而Ucf-101无法阻止cytochrome c的释放。结论：本研究证实脓毒症可能导致Omi/HtrA2由海马神经细胞线粒体向胞浆内转移,通过与XIAP相结合,并降解XIAP,激活下游的细胞凋亡通路。可见Omi/HtrA2信号通路参与介导SAE的发病,Ucf-101通过干预此信号通路对SAE起神经保护作用。