小型化、高效化是靶向抗肿瘤药物的发展趋势，与抗体及其片段相比，靶向肽具有分子量更小、免疫原性更弱的优点。本论文第一部分通过基因工程的方法制备CD13靶向肽NGR（Asn-Gly-Arg）与力达霉素辅基蛋白的融合蛋白，再通过分子强化技术组装发色团，得到有活性的强化融合蛋白，并对其体内外抗肿瘤活性进行研究。第二部分通过化学方法合成抗黏附肽RGD（Arg-Gly-Asp）与云南霉素（yunnanycin，YNM）的偶联物，并研究其抗肿瘤活性。1．CD13靶向肽与力达霉素强化融合蛋白的制备及抗肿瘤活性NGR-CD13是良好的肿瘤新生血管靶向系统，NGR序列与肿瘤血管内皮细胞表达的CD13异构体特异结合。力达霉素（lidamycin，LDM，又叫C1027）是大分子肽类抗肿瘤抗生素，由辅基蛋白（lidaprotein，LDP）和活性烯二炔发色团（active enediyne，AE）构成，发色团具有很强的细胞毒作用但不稳定，辅基蛋白对发色团起保护作用。LDP和AE以非共价键结合，可以拆分和重建，重建后的蛋白具有同样的细胞毒作用，这为体外LDP融合蛋白与AE的分子重建提供了基础。本研究先通过基因工程的方法制备NGR肽与LDP的融合蛋白，再通过分子强化组装发色团，得到有活性的强化融合蛋白，并对其体内外抗肿瘤活性进行研究。以含ldp基因的质粒pEFL为模板，通过PCR的方法得到含信号肽pelB、NGR和LDP编码序列的融合基因sngrldp，信号肽的表达可以使目的蛋白最终分泌到周质腔，同时在sngrldp基因两端加入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点。PCR产物长约0.4kb，将PCR产物通过T4 DNA连接酶连接到T载体，酶切及PCR鉴定后测序。测序无误后，将T载体进行NdeⅠ/XhoⅠ双酶切，得到含粘末端的sngrldp片段，再通过T4 DNA连接酶连接到经同样酶切的pET30a（+）表达载体中。酶切鉴定无误后，将构建好的表达载体转化表达菌E.coli BL21（DE3）star^TM。确认发酵液中有目的蛋白表达后，对发酵条件进行优化。最终确定的诱导条件为：菌体起始密度OD₆₀₀为0.8，IPTG浓度0.05 mM，诱导时间8 h。对目的蛋白纯化前，先通过硫酸铵沉淀法浓缩目的蛋白，硫酸铵浓度为60％饱和度。由于pET30a（+）载体上带有His·Tag标签，故采用NPNTA His·Bind树脂对目的蛋白进行纯化。纯化后的蛋白定量分析，每升发酵液可得到纯度在95％以上的目的蛋白约10mg。纯化产物还原电泳和非还原电泳均得显示单一条带，巯基含量检测发现自由巯基含量约为0.687％，说明NGR-LDP已折叠为正确构象，且并未形成链间二硫键。ELISA法检测NGR-LDP对肿瘤细胞的结合活性，同时以不含NGR序列的rLDP为对照。结果表明NGR-LDP与人纤维肉瘤HT-1080细胞和人乳腺癌MCF-7细胞均能结合，且结合呈浓度剂量依赖性；而rLDP与这两种细胞均无结合。NGR肽能抑制NGR-LDP（50μM）与靶细胞的结合，0.2 mM的NGR肽抑制率约为36.3％，1 mM的NGR肽抑制率约为46.6％。由此进一步确定结合序列为CNGRC。同时Western-blot检测发现HT-1080和MCF-7细胞中均有CD13表达。将力达霉素进行甲醇拆分后得到活性发色团AE，将NGR-LDP与发色团按摩尔比1：5进行组装，经PD-10柱分离，去除多余的发色团，得到NGR-LDP-AE。对产物全波长扫描，发现在340nm和280nm均有吸收峰，而NGR-LDP只在280nm有吸收峰，由于340nm是发色团的特征吸收峰，由此认为融合蛋白已成功组装为NGR-LDP-AE。力达霉素纯品的A₂₈₀／A₃₄₀比值约为2：1，强化后的融合蛋白比值约为3.1：1，因而认为未实现1：1组装，计算重组蛋白中发色团的组装率大约为65％。MTT法检测NGR-LDP-AE对HT-1080和MCF-7细胞的杀伤作用。强化融合蛋白对HT-1080和MCF-7细胞作用48 h的IC₅₀值分别为1.94×10^-9M和2.67×10^-9M，LDM为1.08×10^-10 M和2.44×10^-10 M。而NGR-LDP对两种细胞均无杀伤作用。与力达霉素相比NGR-LDP-AE细胞毒作用下降。本研究发现辅基蛋白对强化融合蛋白的活性有抑制作用，10 nM的rLDP与1 nM的LDM共同作用0.5 h后，洗掉药物，再继续作用48 h，与1 nM的LDM单独作用相比，存活率由62.2％上升到77.4％；两药共同作用48 h存活率由43.3％上升到58.8％。rLDP和NGR-LDP对NGR-LDP-AE的活性也有抑制作用，5 nM的NGR-LDP-AE单独作用0.5 h后，洗掉药物，继续培养48 h，存活率为32.8％；当加入10 nM rLDP或NGR-LDP时，存活率上升为64.5％和62.3％。100 nM BSA使存活率上升为55.67％。尽管高浓度BSA也能抑制NGR-LDP-AE的细胞毒性，但较辅基蛋白为弱，说明LDP对NGR-LDP-AE的抑制有特异性。体内实验采用昆明小鼠皮下移植性肝癌H22模型，分别于接种后3天和10天尾静脉注射给药两次。实验结果显示强化融合蛋白对肿瘤的生长有强烈的抑制作用，实验第16天0.2 mg／kg、0.4 mg／Kg和0.8 mg／Kg三个剂量组的NGR-LDP-AE抑瘤率分别为59.8％、77.8％和94.8％，0.05 mg／kg的游离力达霉素（耐受剂量）抑瘤率为66.9％，未经强化的融合蛋白NGR-LDP基本无抑瘤作用。治疗期间动物体重没有减轻，没有观察到其它明显的毒副作用，表明所用剂量为可耐受剂量。2．云南霉素与抗黏附肽RGD偶联物的合成及其抗肿瘤活性抗黏附肽RGD（Arg-Gly-Asp）的受体是细胞表面的整合素（integrin），通过制备RGD与云南霉素的偶联物，使终产物既具备RGD肽抗黏附的功能，又具有云南霉素杀伤细胞的能力。云南霉素的羟基、氨基用叔丁氧甲酰基（Boc）保护，RGD的羧基用甲酯基（OMe）保护；以2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1，2-二氢喹啉（EEDQ）为缩合剂，使云南霉素的羧基与RGD的氨基缩合得到偶联物；薄层层析（TLC）监测反应进程。利用硅胶制备板对产物进行分离纯化。质谱分析发现终产物终含有分子量分别为773 Da、801 Da和901 Da的成份，分别对应于YNM-RGD、YNM-RGD（OMe）₂和YNM（Boc）-RGD（OMe）₂；HPLC分析三种化合物的总含量为87.16％。MTT显示偶联物和云南霉素对PG细胞的IC₅₀值分别为O.129 mM和0.01 mM，对Bel-7402细胞的IC₅₀值为0.135 mM和0.029 mM，0.1 mM的RGD对两种细胞均无明显的细胞毒作用；1 mM时偶联物、云南霉素和RGD对PG细胞的抑制率分别为73.1％、91.8％和16.9％。Boyden chamber显示0.1 rnM时偶联物和RGD对PG细胞跨膜的抑制率分别为50.9％和40.8％；0.2 mM时为66.4％和56.2％；0.4mM时为66.6％和57.1％；O.1 mM的云南霉素对PG的细胞跨膜能力无明显影响。偶联物兼有云南霉素和RGD的生物活性；与云南霉素相比，偶联物的细胞毒作用下降，但与RGD相比仍有较强的细胞毒作用；YNM-RGD在体外具有抗侵袭的能力，其作用与浓度呈依赖关系。