背景:据我国国家肿瘤中心统计发现:自2008年以来前列腺癌己成为泌尿外科发病率第一的男性恶性肿瘤。雄激素剥夺治疗(ADT)目前是晚期前列腺癌主要的全身性治疗方法,但多数患者在接受2～3年治疗后最终难免会进入雄激素抵抗状态,成为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。迄今我国针对转移性CRPC患者常使用以多西他赛为主的化疗方案。经多西他赛化疗后大部分患者的生活质量可得到改善,总体生存期延长,但经过一段时间的化疗后仍会产生耐药。研究发现了一些机制来解释产生多西他赛耐药的原因。首先,多药耐药基因表型改变。其次,药物靶点突变。第三,微管动力学改变。第四,肿瘤抑制蛋白的改变。同时,融合基因、Bcl-2家族蛋白、NF-κB信号通路、细胞周期信号通路的改变也被认为可引起多西他赛耐药。细胞分裂周期蛋白20(CDC20)是后期促进复合物(APC)的调节剂,可加速有丝分裂退出,与纺锤体组装检查点(SAC)相互作用。在有丝分裂前中期SAC蛋白聚集到着丝点,诱发Mad2的构象改变,有助于其与CDC20和BubRl结合,形成有丝分裂检查点复合物(MCC),为APC抑制剂。在很多肿瘤中都发现了 CDC20表达增高的现象,推测CDC20有助于肿瘤的发生及发展。进一步研究发现在细胞有丝分裂周期中,CDC20通过活化APC形成APCCDC20复合物,从而可与底物蛋白CyclinB、Securin、Bim等细胞周期调控因子结合,使其泛素化,参于有丝分裂调控并抑制细胞的凋亡。其中Bim为凋亡调节蛋白,其降解促进肿瘤生长。因此,CDC20是一种在调控染色体分离和有丝分裂退出中起关键作用的蛋白,位于控制真核生物有丝分裂的多个关键事件的中心节点位置。目的:通过寻找前列腺癌疾病进展中的核心基因并探究该基因在多西他赛耐药的去势抵抗性前列腺癌(CRPC-DR)细胞中的表达情况,寻找其在CRPC-DR细胞中的生物学作用,进一步研究去势抵抗性前列腺癌(CRPC)多西他赛耐药机制,为新的治疗方式提供可选择的作用靶点或途径,拟找到针对CRPC-DR的治疗方法。方法:用生物信息学方法分析公共基因表达数据库GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)找到与课题相关的表达谱芯片,计算筛选出前列腺癌的差异表达基因,将筛选的基因进行GO功能分类与KEGG信号通路分析,构建出蛋白-蛋白互作网络图,挑选在前列腺癌中起重要作用且具有创新性的核心基因进行进一步研究。购买并培养3种前列腺癌细胞LNCaP、PC3和DU145,蛋白免疫印迹和qRT-PCR检测各细胞CDC20蛋白表达及mRNA转录情况。用多西他赛处理去势抵抗性前列腺癌PC3和DU145细胞,以各自亲本细胞的初始IC50开始,通过逐步增加多西他赛的浓度构建完成多西他赛耐药的去势抵抗性前列腺癌细胞(CRPC-DR),即PC3-DR和DU145-DR。利用细胞凋亡试剂盒检测野生CRPC细胞(CRPC-WT)和多西他赛耐药CRPC细胞(CRPC-DR)在多西他赛处理后细胞凋亡率。蛋白免疫印迹和qRT-PCR分别比较CRPC-WT和CRPC-DR细胞中CDC20蛋白和CDC20 mRNA表达情况。利用shRNA技术构建沉默CDC20的DR细胞(shCDC20),免疫印迹和qRT-PCR检测DR细胞和shCDC20细胞中CDC20蛋白和CDC20 mRNA表达情况。利用细胞活性实验检测不同浓度多西他赛处理24小时,对比WT、DR和shCDC20其细胞活性。免疫印迹和qRT-PCR检测在CRPC的WT和DR细胞中Bim蛋白和Bim mRNA的表达。细胞活性实验检测单独或组合沉默CDC20和Bim对DR细胞活性的影响。细胞凋亡试剂盒检测单独或组合沉默CDC20和Bim对DR细胞凋亡的影响。利用细胞活性实验检测不同浓度CDC20靶向抑制剂Apcin与多西他赛协同对于DR细胞活性的影响。细胞克隆实验和细胞凋亡实验检查单独或组合使用多西他赛和Apcin对DR细胞的影响。结果:本课题用生物信息学方法筛选出了 635个前列腺癌中的差异表达基因并构建了相互作用基因网络图,CDC20在互作网络图中居于中心位置,并与79个基因有相互作用,推测其可能是前列腺癌中重要的核心基因。进一步实验研究发现在前列腺癌疾病进展过程中CDC20蛋白表达逐渐增高。课题组首先通过蛋白免疫印迹发现CRPC(PC3、DU145)细胞较激素依赖(LNCap)细胞的 CDC20 蛋白表达量增加(PC3 vs.LNCap P=0.007;DU145 vs.LNCap P=0.013);CRPC细胞较激素依赖细胞CDC20 mRNA表达量显著增高(PC3 vs.LNCap P<0.001;DU145 vs.LNCap P<0.001),提示 CDC20在雄激素依耐前列腺癌细胞中的适度表达,在CRPC细胞中高表达,考虑CDC20在CRPC的进展过程中可能起一定作用。为了研究 CDC20在CRPC多西他赛耐药中的作用机制,我们首先用多西他赛处理两株不同来源的CRPC细胞(PC3和DU45),经过6个月培养,通过细胞凋亡实验发现DR细胞在多西他赛处理后较WT细胞其凋亡明显减少(PC3组P=0.001,DU145组P<0.001)。通过上述细胞功能学实验,研究确定了课题组构建的CRPC-DR细胞对多西他赛耐药的特性。下一步课题组研究 了 CDC20在CRPC多西他赛耐药中的作用情况。首先通过蛋白免疫印迹检查发现CRPC-DR其CDC20 蛋白较 CRPC-WT 明显增多(PC3 组 P<0.001;DU145 组 P<0.001),同时CDC20底物CyclinB蛋白在CRPC-DR中消耗明显增多(DU145组P<0.001;PC3组P=0.002)。同时qRT-PCR检测mRNA表达量也发现CDC20表达增加(PC3组P<0.001;DU145组P<0.001),提示在CRPC-DR细胞中CDC20表达进一步上调。随着前列腺癌疾病的不断进展CDC20扮演着癌基因的作用,推测CDC20可能参与CRPC进展为多西他赛耐药并影响了CRPC对化学药物治疗的敏感性。课题组进一步研究了 CDC20在CRPC-DR细胞中的分子生物学功能。课题组通过使用不同浓度多西他赛处理PC3和DU145细胞,观察其细胞活性变化。我们的数据提示,随着多西他赛药物浓度的升高,WT细胞活性显著减低;DR细胞活性首先出现一个相对耐药的稳定平台期,但在多西他赛浓度大于1nmol时,DR细胞活性也呈现出下降的趋势。然后课题组选用PC3为CRPC代表,通过2种靶向不同mRNA序列的慢病毒转染PC3-DR细胞,成功构建了沉默CDC20的细胞(shCDC20)。通过蛋白免疫印迹发现shCDC20细胞其CDC20蛋白表达较PC3-DR细胞明显减少(P<0.001)。qRT-PCR分析测量shCDC20细胞的CDC20 mRNA表达较对照组明显减少(P<0.001),证实了 2种shRNA均能抑制CDC20蛋白表达,显著降低CDC20 mRNA细胞内含量。细胞活性实验发现对于同一种来源的DR细胞,shCDC20细胞较DR的细胞活性显著减低。通过上述细胞活性实验等数据,说明沉默CDC20后联合多西他赛能明显抑制DR细胞活性,提示CDC20可促进多西他赛耐药的PC3细胞增殖,增加其细胞活性。课题组下一步研究了 CDC20促进CRPC细胞对多西他赛耐药的分子机制。首先用蛋白免疫印迹分别检测WT和DR的CRPC细胞其Bim蛋白表达,数据显示2种DR细胞其Bim蛋白表达较WT细胞明显减少(PC3组P<0.001;DU145组P<0.001)。然后,通过qRT-PCR分别检测WT和DR的CRPC细胞Bim mRNA在转录水平上无明显差异(PC3组P=0.063;DU 145组P=0.106)。上述数据显示多西他赛耐药机制与Bim转录水平调控无关,提示在DR细胞中Bim蛋白水平的下降考虑由蛋白质降解所引起的。课题组使用慢病毒转染PC3-DR细胞,构建单独或组合沉默CDC20和Bim的细胞(shCDC20、shBim和shCDC20+shBim)。通过细胞活性实验发现单纯沉默CDC20细胞活性明显减低(P=0.002),单纯沉默Bim细胞活性明显增加(P=0.003),同时沉默CDC20和Bim其细胞活性与对照组无明显变化(P=0.089)。再对各组进行细胞凋亡实验发现单纯沉默CDC20细胞凋亡明显增加(P=0.012),单纯沉默Bim细胞凋亡明显减少(P=0.003),同时沉默CDC20和Bim其细胞凋亡与对照组无明显变化(P=0.289)。上述实验我们发现稳定沉默CDC20细胞可由沉默Bim后其细胞活性部分逆转。进一步课题组在凋亡比例明显升高的沉默CDC20的PC3-DR细胞中,通过进一步同时沉默Bim其凋亡比例明显逆转,与细胞活性实验的结果相同。这些结果共同说明CDC20通过Bim这一通路调控多西他赛耐药细胞的凋亡和细胞活性。最后,课题组研究了靶向CDC20联合多西他赛作用CRPC-DR细胞的效果。首先使用10nmol多西他赛和不同浓度CDC20靶向抑制剂Apcin处理DU145-DR和PC3-DR细胞,当Apcin浓度≥1 μ mol时2种细胞其细胞活性均明显减低(P<0.001)。单独或联合应用多西他赛和Apcin处理PC3-DR细胞,进行克隆形成实验计算克隆数后发现:与对照组相比2种药物单独治疗均未发现细胞生长明显抑制(多西他赛组P=0.086,Apcin组P=0.313),联合应用时出现协同效应其细胞繁殖能力明显受抑制(P<0.001),细胞凋亡实验发现相同结果。本研究数据提示,对PC3-DR细胞可以通过CDC20特异性抑制剂Apcin联合多西他赛治疗,Apcin的使用可以部分逆转DR细胞对多西他赛的耐药,靶向抑制CDC20可作为多西他赛耐药细胞的一个新的潜在治疗方案。结论:1.CDC20在网络图中居于中心位置是目前列腺癌的核心基因。2.在多西他赛耐药的去势抵抗性前列腺癌中CDC20高表达。3.在前列腺癌细胞中多西他赛耐药与CDC20/Bim路径相关。4.靶向抑制CDC20明显增加多西他赛耐药细胞对多西他赛的敏感性。5.CD C20可作为多西他赛耐药CRPC治疗的一个新的潜在靶点。本研究发现小分子抑制剂靶向CDC20联合化疗药物可治疗多西他赛耐药CRPC,为其提供了一个新的思路。后续我们会尝试进一步研究小分子抑制剂靶向CDC20进行体内实验,进一步完善晚期前列腺癌患者个体化治疗。