第一部分白藜芦醇可以缓解STZ糖尿病大鼠的肾脏损伤目的 观察白藜芦醇对单肾切除+STZ腹腔注射诱导的糖尿病大鼠肾脏损伤的作用。方法 60只正常雄性SD大鼠,右侧单肾切除1周后,随机分为3组：正常对照组(n=10)予以PBS 50mg/kg一次性腹腔注射,每天予以生理盐水5ml/kg/d灌胃；STZ注射糖尿病组(n=25)予以链唑霉素ST Z 50mg/kg一次性腹腔注射,每天予以生理盐水5ml/kg/d灌胃；糖尿病+白藜芦醇组(n=25)予以链唑霉素STZ50mg/kg一次性腹腔注射,每天予以白藜芦醇20mg/kg/d灌胃。干预8周后将大鼠置于代谢笼中,留取24小时尿液标本。分别检测各组大鼠体重、血糖、尿白蛋白排泄率等。麻醉处死大鼠留取肾组织,采用Western blo t、免疫组化等方法检测各组大鼠肾脏SIRT1的变化。结果 1.白藜芦醇治疗对STZ糖尿病大鼠的体重及血糖水平没有明显影响。2.白藜芦醇治疗能明显减少STZ糖尿病大鼠尿白蛋白排泄率,提示白藜芦醇能减少糖尿病大鼠肾脏损伤。3.STZ糖尿病大鼠肾脏SIRT1蛋白表达量小于正常对照组。结论 白藜芦醇对糖尿病大鼠体重及血糖水平没有明显影响,但能有效减少糖尿病大鼠尿白蛋白排泄率；糖尿病大鼠肾脏SIRT1蛋白表达量小于正常对照组。第二部分白藜芦醇通过激活Nrf2改善氧化应激目的 探讨白藜芦醇改善糖尿病肾病的可能机制,是否通过激活Nrf2改善氧化应激从而减轻糖尿病肾脏病变。方法 1.动物实验：正常雄性SD大鼠10只,留取血标本及肾脏组织。采用免疫组化或免疫印迹的方法检测Nrf2、SIRT1在正常肾脏的表达情况。2.细胞实验：培养小鼠肾小球内皮细胞,分别予以如下几种刺激干预：A).高糖刺激模型研究：将已分化的培养肾小球内皮细胞种植至六孔板上,用低糖(2.5mM普通糖)、正常糖(5mM葡萄糖)、高糖(25mM葡萄糖)、以及高糖加白藜芦醇(25mM+RSV1、5、10、25μ M)分别干预24小时。抽取各组细胞蛋白及RNA,用免疫印迹技术及实时定量PCR检测Nrf2、SIRT1表达的水平。采用H2DCFDA荧光标记法检测细胞总ROS的水平。B).氧化应激模型研究：将已分化的培养肾小球内皮细胞种植至六孔板上,用空白对照、sulforaphane (1、2.5、5、10μ M)干预24小时以及过氧化氢500μM干预1小时。收集各组细胞蛋白及RNA,用免疫印迹术和实时定量PCR检测Nrf2、HO-1表达的水平。C).白藜芦醇干预研究：将已分化的培养肾小球内皮细胞种植至六孔板上,用空白对照、白藜芦醇(1、5、10、25μ M)干预24小时。收集各组细胞蛋白及RNA,用免疫印迹术和实时定量PCR检测Nrf2、HO-1表达的水平。结果1.SIRT1和Nrf2在正常SD大鼠的肾脏皮质及髓质均有表达。采用免疫组化染色在正常雄性SD大鼠肾脏标本中发现SIRT1和Nrf2在正常SD大鼠的肾脏皮质及髓质均有表达,且表达量较丰富。采用Western blot方法发现Nrf2在肾髓质的表达量明显高于肾皮质(P<0.05)。Nrf2在肾脏的分布及表达情况与SIRT1在肾脏的分布类似。2.高糖刺激下肾小球内皮细胞Nrf2表达减少,SIRT1表达减少。将内皮细胞分别予以低糖(2.5mM葡萄糖)、正常糖(5mM葡萄糖)以及高糖(25mM葡萄糖)干预24小时。提取各组细胞蛋白,采用Western blot的方法发现高糖刺激状态下,内皮细胞Nrf2及SIRT1蛋白表达减少,提示高糖刺激可能通过下调SIRT1及Nrf2发挥致病作用。3.激活Nrf2可以保护肾小球内皮细胞抵御氧化应激。首先采用了不同浓度的Nrf2激动齐Sulforphane预处理肾小球内皮细胞24小时(浓度梯度为1、2.5、5、10μM),接着给细胞氧化应激刺激：过氧化氢500μM干预1h。结果发现Sulforaphane对Nrf2蛋白表达没有明显影响,但sulforaphane使HO-1产生增多,且呈剂量依赖性。这提示激活Nrf2后HO-1产生增多,保护肾小球内皮细胞抵御氧化应激。4.白藜芦醇能激活肾小球内皮细胞Nrf2-HO-1表达,减少ROS产生,缓解氧化应激。对肾小球内皮细胞采用不同浓度的白藜芦醇干预(0、1、5、10、24小时,提取细胞RNA,采用real-time PCR法检测Nrf2及HO-1 mRNA水平变化,结果发现白藜芦醇能剂量依赖性的增加Nrf2及HO-1 mRNA的水平。高糖刺激+白藜芦醇干预(1、5、10、25μM)后,白藜芦醇能够缓解高糖刺激引起的Nrf2表达减少,增加HO-1 mRNA表达且呈剂量依赖性。白藜芦醇与sulforaphane均能显著减少高糖刺激诱导的ROS产生,且呈剂量依赖性(P<0.05)。5.SIRT1与Nrf2有相关性。将肾小球内皮细胞分别予以低糖(2.5mM葡萄糖)、正常糖(5mM葡萄糖)、高糖(25mM葡萄糖)、高糖+白藜芦醇(25mM+RSV10mM)干预24小时。提取各组细胞蛋白,采用免疫共沉淀的方法分析SIRT1及Nrf2的相关性。结果发现SIRT1与Nrf2特异性结合,且在高糖刺激时这种特异性结合有减少的趋势。结论 白藜芦醇可以通过激活Nrf2,使其下游HO-1表达增多,减少总ROS产生,继而减少氧化应激,缓解糖尿病肾脏病变；SIRT1与Nrf2存在特异性的结合。第三部分高盐饮食可以诱导肾脏髓质间质细胞COX2表达增多目的 探讨高盐饮食对肾脏髓质COX2表达及其表达部位的影响。方法 90只正常雄性C57BL/6j小鼠随机分为两组,分别予以正常盐饮食(0.4%NaCl)及高盐饮食(8%NaCl)0-7天,每天每组处死5只小鼠,留取肾脏皮质及髓质,提取蛋白,采用、Western blot的方法检测COX1及COX2的蛋白表达；留取肾组织,采用原位杂交及免疫荧光染色的方法检测COX2的具体表达部位。结果 1.高盐饮食可以诱导肾脏髓质COX2的表达增多,而对COX1的表达没有影响。Western blot结果提示高盐饮食2天即能够诱导肾脏髓质COX2的蛋白表达增多,而且这种高表达一直持续到第7天研究结束。相反肾髓质COX1的蛋白表达一直较高,并不受高盐饮食的影响。2.高盐饮食诱导肾脏髓质COX2的表达增多主要位于肾脏髓质间质细胞。原位杂交的结果显示COX2 mRNA主要表达在肾脏髓质,特别是小管间的髓质间质部位；而COX1 mRNA主要表达在肾脏髓质的集合管。免疫荧光共染结果提示COX2表达在肾脏髓质细胞的细胞核周围,排列成阶梯状。COX2的免疫荧光与AQP2、AQP1、CLC-K、CD31等指标的荧光表达没有重叠,提示高表达的COX2主要位于肾脏髓质间质细胞。结论 高盐饮食能够诱导肾脏髓质COX2表达增多,且这种高表达的COX2主要位于肾脏髓质间质细胞。第四部分高盐饮食通过激活肾脏髓质间质细胞NFκB诱导COX2的高表达目的探讨高盐饮食是否通过NFκB信号通路诱导肾脏髓质间质细胞COX2表达增多。方法 1.采用两种分别携带NFκB启动子驱动Luciferase报告基因以及NF K B启动子驱动绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白基因的HLL转基因小鼠,予以正常盐饮食(0.4%NaCl)或高盐饮食(8%NaC1)3天后处死,留取肾脏组织。分别采用荧光素酶检测试剂盒检测1uciferase荧光素酶含量,免疫荧光法检测EGFP的表达部位。2.10只c57BL/6j雄性小鼠予IκB激酶选择性抑制剂IMD-0354 8mg/kg或安慰剂灌胃5天,第3天起分别予以正常盐饮食(0.4%NaC1)或高盐饮食(8%NaCl)3天。最后一天将小鼠置于代谢笼中,自由饮水,留取24小时尿样。采用Westernblot方法检测肾髓质COX2蛋白表达,采用ELISA方法检测尿液中PGE2的排泄。3.30只正常雄性C57BL/6j小鼠分别予以蛋白酶体抑制剂硼替佐米或生理盐水0.5mg/kg iv. biw,随后分别予以正常盐饮食(0.4%NaCl)或高盐饮食(8%NaCl)3天。最后一天将小鼠置于代谢笼中,自由饮水,留取24小时尿样。采用Western blot方法检测肾髓质COX2蛋白表达,并检测24小时尿钠排泄情况。结果1.高盐可以增加肾髓质间质细胞NFκB的活性。NFκB驱动的luciferase报告基因活性结果显示高盐饮食明显增加了肾髓质NF K B活性,较正常饮食组增加7倍(3626±1045 vs 513±248 unit/mg protein, n=10, P<0.05)。免疫荧光检测结果显示高盐饮食后NF K B-EGFP报告小鼠肾髓质EGFP荧光表达量明显高于正常盐饮食组,且EGFP主要在肾髓质小管间呈阶梯状排列,与肾髓质间质细胞的分布相符。2.NFκB抑制剂减弱了高盐饮食对肾髓质COX2表达的诱导。使用NFK B选择性抑制剂IMD-0354治疗的小鼠能够持续减弱高盐饮食对肾髓质COX2表达的诱导,且其尿液中PGE2的排泄减少(809+267vs 1798±578 mg/24h, n=3,P<0.05)。3.蛋白酶体抑制剂硼替佐米减弱了高盐饮食对肾髓质COX2表达的诱导,并且抑制了高盐饮食引起24小时尿钠排泄增多。结论 高盐饮食通过激活肾脏髓质间质NFκB诱导COX2的表达,从而调节钠的平衡。