背景胰腺癌是世界第四大恶性肿瘤,侵袭性高,转移早,无特异性症状,死亡率高。中位生存时间仅3-6个月,5年生存率<5%。在中国,胰腺癌的发病率在过去20年里增长了 6倍,其中,2017年中国胰腺癌的发病率为4.8/10万,在当年所有恶性肿瘤发病率中排名第七。胰腺癌的根治性治疗仍以手术切除为主,然而只有15-20%的胰腺癌患者适合手术治疗。即使多学科综合治疗,晚期胰腺癌患者的中位生存时间也只有6个月左右。胰腺癌死亡率高的主要原因是胰腺癌在转移到其他器官之前未能早期诊断,以及胰腺癌容易通过调节基因的表达从而对现有的放化疗等手段产生耐药。MACC1(结肠癌转移相关基因1)是调节上皮间质转化过程的一个重要基因,该基因编码的受体肝细胞生长因子(HGF)。在恶性肿瘤中,MACC1参与凋亡诱导因子的失活和细胞周期的促进被认为有助于癌症的浸润和转移。MACC1被认为是恶性肿瘤的一个标志或其他类型的癌症的预后指标,包括结肠癌,肺腺癌、宫颈癌、肝癌和食道癌。在胰腺癌中,关于MACC1的研究很少。Wang Gang等人证明MACC1通过调控Ras/ERK信号通路在胰腺癌耐药及上皮简直转化中发挥重要作用,但MACC1在胰腺癌患者中表达和预后价值,以及MACC1在胰腺癌发生发展中起到的作用尚未完全揭示。随着基因芯片和RNA-seq等高通量技术的发展,通过生物信息学已经能够从整体的基因表达数据中识别目标基因的意义。据我们所知,生物信息学方法还没有被用于探索MACC1在胰腺癌中的作用。目的我们希望了解MACC1的预后价值以及其在胰腺癌发生中的靶向信号通路的关键作用。这些发现可能为今后胰腺癌患者的研究和临床实践提供新的视角。材料与方法1 收集2017年3月-2019年11月在郑州大学第一附属医院行胰十二指肠切除术的胰腺癌患者的癌症组织25例及相应癌旁组织,患者在术前均签署了知情同意书。所有癌或癌旁组织获取后均放入液氮罐长期保存。而后我们采用实施定量PCR的方法检测这25例胰腺癌及相应配对癌旁组织中MACC1的表达,并进行可视化和统计检验。2 利用生物信息学的相关方法、数据库及程序语言,对Oncomine数据库,GE0数据库和TCGA数据库中有关胰腺癌的400份二代测序数据进行挖掘,从而得出MACC1在胰腺癌组织中mRNA表达的普遍结论,并在人类蛋白质图谱数据库(Human Protein Atlas)中提取MACC1蛋白在胰腺癌组织中的免疫组化情况,分析蛋白表达趋势从而加以验证。3 提取CCLE细胞系数据库中的二代测序基因表达数据,得出MACC1在ASPC-1和PANC-1胰腺癌细胞系中的表达。对较高表达MACC1的ASPC-1细胞系,设计并转入相应的sirna进行基因表达敲低处理,对较低表达MACC1的PANC-1细胞系,设计并转入相应的质粒进行过表达处理。4 通过对TCGA中的179个胰腺癌组织二代测序数据进行提取整合,标准化。并通过R语言用基因富集分析(GSEA)算法来预测出MACC1在胰腺癌中可能的作用及作用通路。5 对上述处理过的细胞系及各自的对照组,在体外实验中应用CCK-8试剂盒法和平板克隆形成实验检测增殖变化情况、应用细胞迁移及侵袭及实验来检测癌细胞迁移及侵袭能力的变化、向实验组及对照组加入凋亡相关探测试剂,通过流式细胞仪来检测转染前后胰腺癌细胞凋亡的变化情况。6 在上述实验组及对照组中,利用免疫印迹法(western blot)检测由GSEA预测出的相关通路中的关键蛋白,找出蛋白表达有差异的通路。7、所有数据均采用R 3.6.1及Prism 6.0统计分析。单因素方差分析和双侧t检验用于定量资料的比较。卡方检验用于定性资料的比较。所有数据以均数±标准误(X±SEM)表示。α<0.05具有统计学意义。结果1.在25例胰腺癌组织中,MACC1的表达相对于配对的癌旁组织显著升高。2 0ncomine分析中,MACC1的表达在6项胰腺癌分析中均有异常,说明MACC1 mRNA是胰腺癌的良好的生物标志物。MACC1在Oncomine的Pei胰腺癌队列中显著上调,其中包括36例胰腺癌样本和15例正常胰腺组织(P<0.05)。GEPIA分析的结果,GSE15471和GSE28735的配对比较也证实了这一结论。TCGA的数据合并临床信息后得出,MACC1的高表达与临床分期高、病理分级高、预后差密切相关。人类蛋白图谱计划中的免疫组化数据也证实胰腺癌组织中MACC1蛋白水平高于正常组织。3 从数据库CCLE结果表明MACC1的表达在ASPC-1 比PANC-1高。根据这一发现,我们选择ASPC-1转染siRNA和PANC-1与MACC1转染质粒。过表达MACC1能促进增殖和表达下调MACC1可以抑制胰腺癌细胞的增殖。此外,据GSEA的结果,相关通路包括“细胞周期相关”和“胰腺癌相关”也富集在TCGA-PAAD队列。克隆形成、迁移、侵袭和流式细胞术检测结果表明,上调MACC1表达可促进肿瘤迁移、侵袭,抑制胰腺癌细胞凋亡。下调的MACC1可以抑制胰腺癌细胞的肿瘤迁移、侵袭和凋亡。另外,GSEA分析的一些相关结果也证实了 MACC1作为肿瘤启动子和凋亡抑制剂的潜在功能4 评估的确切信号通路参与MACC1,我们搜查了潜在的信号通路在GSEA结果上方和一些途径与高度相关(P<0.05),其中包括p53信号通路(P<0.001),Notch信号通路(P=0.014),和Rig I样受体信号通路(P=0.029)。经western blot检测,我们证实胰腺癌细胞中MACC1表达水平下调后,Notch1、Hey1、Hes1等Notch信号通路相关蛋白表达下调,p53、MDM2等p53信号通路相关蛋白表达明显改变。这些结果表明,通过p53和Notch信号通路,MACC1在胰腺肿瘤发生中发挥重要作用。结论我们的研究表明,MACC1在胰腺癌组织中显著高表达,与较差的临床分期、病理分级、总体生存时间和无进展时间有明显的相关性。MACC1过表达可通过激活P53和Notch信号通路促进胰腺癌的恶性表型。