宫颈癌是女性最常见的生殖道恶性肿瘤之一,全球每年约有50万的新发例,其中90%以上发生在发展中国家。我国每年新发病例占世界总数的近1/3。宫颈癌是严重危害我国女性健康的疾病,是值得研究的重大疾病。研究发现宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)是宫颈癌前期病变,其既可以进展为癌,也可以自然消退。高危型人乳头瘤病毒(high risk human papillomavirus,HR-HPV)持续感染是宫颈癌发生以及CIN进展为宫颈癌的重要因素,但只有大约1%的HR–HPV感染者最终发展为宫颈癌,并且从CIN到宫颈癌大约还需要8-10年之久,由此提示除了HR–HPV这个主要的因素外,可能还有其他因素在宫颈癌的发生和发展中起到了协同作用。因此,探寻这些协同因素对于阐明宫颈癌的发生、发展及宫颈癌的预防均具有重要的意义,有利于宫颈癌发病机制的研究,有利于宫颈癌的人群预防。有文献报道在HR-HPV(尤其是HPV-16)感染的妇女中补充叶酸有可能减低宫颈上皮内瘤变2级(CIN2)及以上病变发生的风险。miRNA可调控细胞增殖、凋亡、分化、代谢、癌变及自噬。课题组前期通过选择叶酸含量缺乏与不缺乏的宫颈上皮内瘤变及癌组织进行miRNA芯片筛查,筛选出与叶酸含量及宫颈病变级别相关的差异表达的miRNA,其中miR-224的表达差异显著。miR-224作为micro-RNAs家族的一员,参与肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡、浸润及转移等过程,在肿瘤的发生和发展中起着重要的作用。miR-224在某些肿瘤中高表达,如肝癌、乳腺癌、结直肠癌、宫颈癌等;在某些肿瘤中低表达,如前列腺癌和卵巢癌。在不同的癌症中miR-224通过作用于不同的靶基因促进或抑制肿瘤细胞的浸润或转移。已有研究发现miR-224可通过Smad4抑制B型病毒性相关肝癌细胞自噬,有实验证明在正常组织中长期慢性地抑制细胞自噬,激活肿瘤生成过程,细胞自噬的抑制可能会加重坏死细胞的局部炎症反应,从而导致肿瘤的生长。与此同时,细胞自噬也扮演了一个对抗肿瘤生成的角色,细胞自噬可能与肿瘤发生、发展关系密切,细胞自噬相关蛋白Beclin1是启动自噬的关键蛋白,是第一个被证实的与细胞自噬活化直接相关的肿瘤抑制基因,Beclin1缺失易引起肿瘤。LC3是迄今为止发现的唯一定位于自噬泡内膜,参与多种信号传导调节的蛋白,是细胞自噬发生的良好的标志物。有报道显示叶酸缺乏条件下培养的小鼠胚胎干细胞可发生自噬,自噬相关基因表达上调,从而促进了自噬的发生。但叶酸缺乏情况下miR-224对宫颈癌细胞自噬的影响及机制尚未见报道。本项目拟对叶酸缺乏条件下miR-224对宫颈癌细胞自噬的影响及机制进行研究,以细胞自噬为切入点,旨在探索叶酸缺乏与宫颈癌细胞自噬的关系,为宫颈癌的发生机制研究提供参考,有望为宫颈癌的预防提供部分依据。第一部分山西省介休地区宫颈上皮内瘤变危险因素的研究目的:探讨山西省介休地区妇女宫颈上皮内瘤变的相关危险因素,为宫颈癌的预防提供人群依据。方法:于2014年6月~2014年11月间,对山西省介休地区居住一年以上的已婚、18岁至小于等于65岁符合标准的20000名现场人群,行宫颈上皮内瘤变相关危险因素问卷调查和宫颈细胞学检查,对细胞学检查结果为意义不明确的非典型鳞状细胞(atypical squamous cells of undeterminedsignificance,ASC-US)及其他异常者,行阴道镜检查及组织病理学检查,将检出的宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)者作为病例组,包括CIN1组和CIN2/3组,细胞学结果异常但病理组织学检查正常,并自愿进入后续研究者作为对照组。对进入后续研究队列的研究对象进一步进行膳食叶酸摄入调查、阴道微生态检测和人乳头瘤病毒检测(human papillomavirus,HPV)。采用有序Logistic回归分析方法,分析CIN发生相关的危险因素。(1)宫颈细胞学及病理学检查结果:通过细胞学检测,在20000例中检出ASC-US及其他异常者1438例(包括宫颈腺细胞异常者),占7.19%,其中ASC-US1270例、不能排除高度鳞状上皮内病变的非典型鳞状上皮细胞(atypical squamous cells,cannot excludehigh grade squamous intraepithelial lesion,ASC-H)7例、低度鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepitheliallesion,LSIL)125例、高度鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)32例、非典型腺体细胞(atypical glandular cells,AGC)2例和宫颈鳞状细胞癌(squamous of cervical carcinoma,SCC)2例。病检结果为CIN和SCC者共421例,总检出率为421/20000(2.05%;95%CI,1.85–2.25);其中CIN1共317例(1.58%;95%CI,1.41–1.76),CIN2/3共93例(0.50%;95%CI,0.37–0.56)和SCC 11例(95%CI,27–99);检出CIN2及以上病例共104例(0.52%;95%CI,0.42–0.62)。最终,进入后续研究队列者1036例。(2)HPV检测结果:1036例中检测出高危型人乳头瘤病毒(High-risk human papilloma virus,HR-HPV)阳性293例,总阳性率为28.28%;CIN 1组HR-HPV阳性率为25.87%、CIN2/3组HR-HPV阳性率为76.34%,对照组阳性率22.36%,阳性率在各组之间相比较具有显著性差异(P<0.001);HR-HPV阳性率随CIN病变程度加重呈趋势性增高(P<0.001);前三位感染型别是16、58和51型。(3)阴道微生态检测结果:CIN 1、CIN2/3组与对照组间滴虫性阴道炎、外阴阴道假丝酵母菌病、细菌性阴道病及其他类型阴道炎检出率比较无显著性差异(P=0.079)。(4)膳食叶酸摄入调查结果:病例组平均每日经膳食叶酸摄入量为344.61±153.07ug,与对照组(371.50±166.58ug)相比有显著性差异(P<0.001)。(5)宫颈上皮内瘤变危险因素分析结果:(1)经单因素分析,危险因素包括:年龄、文化程度、本人职业、丈夫职业、性生活后是否清洗外阴、是否采用绝育手术避孕、绝育术年限、HPV感染、HR-HPV感染及平均每日经膳食摄入叶酸量。(2)将上述因素进行多因素分析,结果显示宫颈上皮内瘤变的危险因素包括:高危型HPV感染、年龄56-65岁、丈夫职业为农民、性生活后不清洗外阴、平均每日经膳食叶酸摄入量较少。结果:结论:(1)山西省介休地区CIN及SCC检出率较高;(2)CIN的主要危险因素洗外阴及经膳食叶酸摄入量较少。包括高危型人乳头瘤病毒感染、年龄56-65岁、丈夫职业为农民、性生活后不清第二部分miR-224调控Smad4对宫颈癌细胞生物学功能影响及机制研究目的:探讨miR-224对Smad4的影响,进一步明确miR-224能否通过调控Smad4对宫颈癌细胞生物学功能产生影响。方法:通过预测靶基因的网站预测miR-224的靶基因。使用实时荧光定量q RT-PCR法检测miR-224和Smad4表达量。为了明确miR-224在宫颈癌靶向Smad4,在宫颈癌细胞株Si Ha和He La中,利用细胞转染技术过表达或沉默miR-224,采用实时荧光定量PCR法定量检测miR-224转染效果进行验证。在miR-224过表达或沉默的Si Ha和He La细胞中,采用CCK-8法、流式细胞检测法、细胞划痕实验对细胞增殖、凋亡、迁移的生物学行为进行检测。在miR-224过表达或沉默的Si Ha和He La细胞中,采用实时荧光定量PCR法及westen blot法对Smad4从m RNA水平和蛋白进行检测,进而研究miR-224通过调控Smad4对宫颈癌细胞生物学功能的影响及作用机制。结果:通过生物信息学靶基因预测网站Smad4被预测为miR-224的一个靶基因,miR-224可以与Smad4的m RNA3′UTR高度结合。在宫颈癌细胞株Si Ha和He La中,与正常细胞相比,宫颈癌细胞中miR-224的定量检测结果显示其高表达,Smad4的m RNA低表达。给予miR-224过表达和沉默建立转染细胞模型。在Si Ha和He La中成功转染miR-224 mimic和miR-224 inhibitor后,过表达miR-224可促进Si Ha和He La细胞增殖、迁移,抑制细胞凋亡;而沉默miR-224抑制Si Ha和He La细胞增殖、细胞迁移,促进细胞凋亡。miR-224与Smad4的检测结果显示:在miR-224 mimic转染的Si Ha和He La细胞中,miR-224表达明显升高,Smad4蛋白表达明显下降;而在miR-224 inhibitor转染的Si Ha和He La细胞中,miR-224表达降低,Smad4表达升高。结论:在宫颈癌Si Ha和He La细胞中,miR-224过表达可促进细胞增殖和迁移、抑制细胞凋亡;而沉默miR-224可抑制细胞增殖和迁移、促进细胞凋亡。过表达miR-224可下调Smad4的表达,沉默miR-224可上调Smad4的表达。第三部分叶酸及miR-224调控Smad4影响宫颈癌细胞自噬的初步研究目的:探讨叶酸及miR-224对宫颈癌细胞自噬的影响,并对miR-224调控Smad4对于自噬的影响进行初步研究。方法:采用实时荧光定量PCR法检测miR-224及Smad4的m RNA在宫颈组织中的表达,采用western blot法检测上述组织中的miR-224和Smad4的蛋白的表达。在宫颈癌细胞株Si Ha和He La中,利用细胞转染技术过表达或沉默miR-224,采用实时荧光定量PCR法定量检测miR-224的表达并对转染效果进行验证。并且采用实时荧光定量PCR法及western blot检测miR-224过表达或沉默的Si Ha和He La细胞中自噬相关基因Beclin1、LC3和p62及Smad4的m RNA及蛋白的表达情况。进一步采用不同浓度的叶酸溶液干预上述细胞后,检测Si Ha和He La细胞中自噬相关基因Beclin1、LC3、p62和Smad4及其蛋白的表达情况。在宫颈组织中miR-224和Smad4的m RNA及蛋白均有表达。与正常细胞相比,Si Ha和He La细胞的定量检测结果显示miR-224表达显著增加,Smad4m RNA表达减低。在Si Ha和He La细胞中成功转染miR-224 mimic和miR-224inhibitor后,miR-224 mimic可减少Beclin1、LC3、Smad4表达,而p62表达增加。而在miR-224 inhibitor转染的Si Ha和He La细胞中,Beclin1、LC3、Smad4表达增加,而p62表达减少。采用不同浓度叶酸溶液干预Si Ha、He La细胞后,结果显示在m RNA及蛋白水平,Si Ha和He La细胞中Beclin1、LC3、Smad4表达均增加,p62表达均减少。结果:结论:miR-224通过Smad4影响宫颈癌细胞自噬水平。叶酸可影响宫颈癌细胞自噬。