帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是第二大神经系统退行性疾病。PD的特征性病理变化为黑质、纹状体多巴胺(dopamine, DA)神经元和DA的进行性丢失,以及神经元内嗜酸性包涵体Lewy小体形成。随着帕金森病病情的进展,黑质-纹状体通路及与之具有解剖联系的神经区域相继受累,从而导致患者出现静止性震颤、肌强直、运动迟缓等运动障碍症状,以及便秘、多汗、性功能障碍、失眠、抑郁、焦虑、认知障碍等一系列自主神经及精神症状。目前临床对帕金森病的治疗亦仅限于对症支持治疗,未能从根本上阻止病变的进展,因而神经病学界一直视帕金森病为难治的“三不”(病因不明、疗效不好、预后不良)性疾病。虽然病因不明,遗传易感性、年龄老化、环境毒素等原因均与帕金森病发病有关联。鱼藤酮是一种天然有机杀虫剂,可选择性抑制细胞内线粒体复合物Ⅰ,造成线粒体功能障碍及能量供给不足,并产生大量氧自由基,使对氧化应激具高度敏感性的黑质纹状体DA系统变性损伤。鱼藤酮模型可以很好地模拟人类PD慢性进展病程,符合PD行为学和神经化学改变,并能观察到路易小体的形成,是较为理想的帕金森病模型,对研究评价帕金森药物的神经保护作用有很好的作用。寻找治疗PD的新方法是当今PD临床与科研的重要课题。由于目前帕金森的发病机制尚未完全明确,其治疗亦缺乏特异性。目前帕金森病的治疗仍以药物为主,主要的目的是控制临床症状。现有的研究显示,中脑黑质多巴胺能神经元变性坏死导致多巴胺含量减少,由此出现一系列包括运动系统和非运动系统功能障碍的临床症状。目前临床上针对帕金森的药物,大都基于中枢神经系统多发胺含量来展开,或外源性地提高其含量,或减少多巴胺的丢失。使用药物对抗帕金森病,症状在短时间内可有效地控制,长期使用则不可忽视地出现明显的不良反应,最常见的有恶心、呕吐、腹痛等消化道症状。而中药因为其具有个性化的治疗方案,可以兼顾并发症,毒副作用小,与西药联合用药是还可以提高西药的疗效以及减轻西药的毒副作用,故而成为帕金森病的治疗中的一个研究热点。中医将帕金森病归为“颤病”,历代医家对病因病机有诸多论述,但总以风动为主。三甲复脉汤具有滋阴复脉,潜阳熄风,养心安神,痰瘀并治,补肾健脑等功效,与颤病之病机相合。实验目的：研究三甲复脉汤对帕金森病大鼠多巴胺神经元的影响,并根据大鼠神经行为学检测以及大鼠多巴胺神经递质的改变情况观察三甲复脉汤对帕金森病的疗效。实验方法：实验一：雄性Wistar大鼠30只,使用随机区组设计,分3组,正常组、溶剂对照组、模型组。正常组不予处理。溶剂对照组采用颈部皮下注射法按1ml/kg注射葵花油。模型组动物也采用颈部皮下注射法,按1ml/kg注射鱼藤酮葵花油乳化液,鱼藤酮在葵花油乳化液中浓度为2mg/ml。各组均观察4周时间,实验开始前予称重及悬挂实验检测。实验开始后每周行称重及悬挂实验等行为学检测,持续4周。实验结束后,取材检测。实验二：雄性Wistar大鼠50只,使用随机区组设计,分5组,每组10只,分别为正常组、溶剂对照组、模型组、美多芭组、三甲复脉汤组。空白组：不做任何处理,第5周开始以生理盐水2ml灌胃,每天1次,持续2周。溶剂对照组：采用颈部皮下注射法按1ml/kg注射葵花油,每天注射1次,连续注射4周。第5周开始每天以生理盐水2ml灌胃,每天1次,持续2周。模型组：采用颈部皮下注射法按1ml/kg注射鱼藤酮葵花油鱼藤酮葵花油乳液,每天注射1次,连续注射4周。第5周开始每天以生理盐水2ml灌胃,每天1次,持续2周。美多芭治疗组：采用颈部皮下注射法按1ml/kg注射鱼藤酮葵花油鱼藤酮葵花油乳液,每天注射1次,连续注射4周。第5周开始每天以美多芭混悬液2ml灌胃,浓度为22.5g/kg,每天1次,持续2周。三甲腹脉汤组：采用颈部皮下注射法按1ml/kg注射鱼藤酮葵花油鱼藤酮葵花油乳液,每天注射1次,连续注射4周。第5周开始每天以三甲复脉汤2ml灌胃,浓度为3g/ml,每天1次,持续2周。实验开始前,对大鼠进行称重及选调实验检查,其后每周进行大鼠体重及进行悬吊实验检测。实验结束后取材检测。实验结论：1、采用颈部皮下注射鱼藤酮的方法建立帕金森病大鼠模型成功。2、鱼藤酮诱导的帕金森病大鼠出现活动能力下降、体重下降等情况等症状,提示大鼠神经系统受损。3、鱼藤酮诱导帕金森病大鼠中脑黑质及纹状体HE染色可见神经元神经细胞数目明显减少,形态也发生改变,同时残留的神经元发生变性,主要表现为胞浆呈嗜伊红浓染；在放大倍数的HE染色黑质切片中,可见胞浆中存在圆形的粉红色嗜酸性小体。4、鱼藤酮诱导帕金森病大鼠中脑黑质及纹状体酪氨酸羟化酶免疫组化检测可见酪氨酸羟化酶阳性细胞明显减少。5、鱼藤酮诱导帕金森病大鼠中脑黑质及纹状体α-突触核蛋白含量增加。6、三甲复脉汤灌胃后帕金森病大鼠的活动能力增强,路易小体数量减少,酪氨酸羟化酶数量增加,a-突触核蛋白含量减少。其对神经元的保护作用可能与保护酪氨酸羟化酶以及抑制a-突触核蛋白基因表达有关。讨论：1.帕金森病动物模型的选择本实验采取的是背部皮下注射鱼藤酮葵花油乳液的方法制造帕金森大鼠模型。这是一种死亡率低,成功率高,且成本较少的造模方法,但缺点是造模时间长。首先,我们的方法能够复制帕金森病最典型的病理特征,黑质、纹状体多巴胺能神经元特异性损害。其次,我们的模型能够复制帕金森病的临床特征。本实验结果中,模型动物出现的主动活动减少、动作迟缓、弓背等症状属于典型的PD症状,毛色与体重问题可能也与PD症状相关。2.实验结果的讨论酪氨酸经化酶(tyrosine hydroxylase, TH)可以催化L-酪氨酸发生经化反应生成L一多巴,酪氨酸经化酶在生物体内的变化会直接影响到多巴胺的生物合成。观察TH免疫组织化学染色图片,与正常组和溶剂对照组相比,模型组、美多芭组及三甲复脉汤组大鼠中脑黑质区TH表达显著降低,尤其是模型组。同时,美多芭组及三甲复脉汤治疗组大鼠比模型组大鼠中脑黑质区的TH表达明显增强。从组织学方面证明了PD模型的成功建立,也说明了三甲复脉汤可以缓解鱼藤酮对大鼠中脑黑质及纹状体造成的损害。通过流行病学和基因遗传学研究,很多与帕金森病发病相关的基因相继被发现,主要包括α-突触核蛋白(α-synuclein)、泛素羟基端水解酶-L1(ubiquitin carboxy terminal hydrolase-L1, UCH-L1)、Parkin和DJ-1蛋白等对应的编码基因。其中,α-突触核蛋白基因是第一个被发现的“帕金森病基因”,该基因很容易发生错义点突变,是早发型家族性帕金森病的致病因素。不论是家族性帕金森病还是散发性帕金森病,路易小体是其典型的病理特征之一,而路易小体的主要成分是纤维性α-突触核蛋白聚集。此外,α-突触核蛋白表达增多也是一个重要因素。鱼藤酮皮下注射可诱导大鼠中脑黑质及纹状体中α-突触核蛋白表达增加,从而诱导帕金森病的发生。而三甲复脉汤可以抑制这一过程,从而减少路易小体的形成,改善帕金森病大鼠的症状。