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人OX40配体(OX40L或CD134L)属TNF超家族成员，为Ⅱ型跨膜糖蛋白，Mr约34～40kD，编码183个氨基酸。人OX40L由Miura等于1991年克隆，最初命名为gp34，基因长约1kb，定位于人染色体1q25。人OX40L具有广泛的表达谱，主要表达于成熟的树突状细胞(DC)、活化的B细胞、血管内皮细胞(ECV)、人脐带静脉血管内皮细胞(HUVEC)、巨噬细胞以及心、骨骼肌、睾丸和肺等组织器官。在机体的免疫应答过程中，OX40／OX40L作为一对重要的共刺激分子，为T、B细胞的激活提供了重要的共刺激信号。它们的相互作用能促进CD4~+T细胞的活化、增殖、迁移并延长其寿命，能促进生发中心(GC)的形成，还能促进DC分化成熟及细胞粘附。近年研究表明，在肿瘤免疫应答的介导和自身免疫性疾病的发生发展中，OX40／OX40L发挥了重要作用，且OX40只在炎症和肿瘤浸润部位的抗原特异性T细胞上特异高表达，使其成为一个理想的免疫干预靶分子。因此，OX40L转基因细胞的构建、OX40L分子的激动剂或拮抗剂的研制及其在OX40／OX40L信号传导和调节中的作用的研究将在肿瘤、移植排斥反应、自身免疫性疾病中具有重要的理论研究和临床应用价值。 1．人OX40L基因的克隆及转基因细胞的构建 本研究通过RT-PCR方法，从成熟DC的总RNA中扩增出编码人OX40L全长的cDNA片段，通过基因克隆技术，将其插入逆转录病毒载体pEGZ-Term。进一步通过脂质体转染技术将重组表达载体与辅助病毒载体共转染包装细胞293T，用其培养上清感染L929细胞72h后，经Zeocin筛选出稳定表达OX40L分子的L929细胞株(L929／OX40L)。经体外长期传代和液氮反复冻存和复苏，转基因细胞生长良好，OX40L的表达稳定在95％以上。 2．L929／OX40L转基因细胞对T细胞的共刺激作用人OX4OL转基因细胞的构建与单克隆抗体的研制及其生物学功能的研究摘要 将反应T细胞用抗人CD3激发型单抗或联合CD3和抗CD28单抗激发Zd后，加入刺激细胞L929/o x40L或L929/m ock，共培养3d。3H一TdR掺入法显示，L929/o X4OL细胞能有效地促进T细胞增殖，而联合抗CD28单抗，促增殖效应则更为显著。细胞表型分析L929/OX4OL能促进CD4+T细胞活化。同样，细胞周期及凋亡检测表明，该转基因细胞能促进T细胞增殖抗凋亡。ELIsA法检测培养上清细胞因子表明，L929/O X40L能明显促进T细胞对几一2、几一10和环N邓的分泌。3.分泌鼠抗人0X40L单抗的杂交瘤细胞株的制备 利用上述构建的转基因细胞L929/OX40L为免疫原，免疫BALB/c小鼠，采用B淋巴细胞融合技术，将反复免疫后的小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SPZ/0进行细胞融合，以此转基因细胞作为阳性筛选细胞，以转空质粒的对照细胞L929/mock作为阴性对照细胞，经免疫荧光标记分析及抗体分泌阳性孔内杂交瘤细胞的反复筛选，并经多次克隆化培养，最终获得6株持续、稳定分泌鼠抗人OX40L单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为gH10、4C12、IE7、SD10、4H4和IGI。经快速定性试纸法分析鉴定，gH 10、1 E7、4H4和1 Gz的重链均为IgGI;4C12的重链为IgOZb:8D10为IgGZa，而轻链均为K。经体外连续传代(40代)培养，液氮冻存半年后复苏，仍生长良好，稳定分泌抗体。 继而采用本室建立的腹水诱生和纯化方案，腹水形成阳性率为95%以上，腹水的产量平均约为5，oml/只小鼠。经ProteinG亲和层析柱分离纯化，腹水型单抗纯化后蛋白含量在0.8一10mg/ml之间。纯化后单抗的效价为卜1000以上，抗体蛋白用于间接免疫荧光分析的用量为。.2一2林留1、1护细胞。4.鼠抗人0x40L单克隆抗体的体外生物学特性研究 以L929/OX40L为竞争靶细胞，经间接免疫荧光标记的竞争抑制试验，结果显示，SD10与gH10识别OX4OL分子的抗原位点完全相同，4C12与4H4也能识别另一相同的0X40L分子的抗原位点，而IE7和IGI则识别其他不同的抗原位点。另外，经间接免疫荧光标记显示，9H10、4C12和IE7能特异性识别活化的B细胞及成熟DC所表达的OX40L分子。 生物学功能的研究结果表明，5株单抗均能抑制单向和双向混合淋巴细胞反应，而另一株单抗IE7作用则相反，它能联合激发型 CD3单抗促进T细胞增殖。提示这人OX4OL转基因细胞的构建与单克隆抗体的研制及其生物学功能的研究摘要6株单抗均为功能性抗体，它们在器官移植的排斥反应、自身免疫性疾病及肿瘤等的防治中可能具有潜在的应用价值。5.抗人0X40L单抗介导的逆向信号对B细胞和DC的作用 经ELISA法分析，在T细胞依赖的PWM激发的B细胞培养体系中，抗人0X40L单抗gH 10、4C12和1 E7均能促进T细胞依赖性B细胞分泌抗体。经流式细胞仪对DC表型分析，在抗CD40单抗激发的基础上，抗人上调DC上CD80、CD86、CD83和CXCR4的表达，OX40L单抗(9H10)能进一步促进DC且ELISA法分析显示，联合单抗gHID泌更多IL一2和IFN一7，而IL一4和IL一10和抗CD40单抗刺激的进一步分化成熟。而DC能促进T细胞分则无明显变化。说明联合抗人OX40L单抗(gH10)和抗CD40单题咖‘bC综上所述，本研究成功克隆了人能进一步促进T细胞向Thl方向分化。OX40L基因、构建了转OX40L的转基因细胞并研制了6株能稳定分泌特