家蚕新绿茧(Gn)位点相关长链非编码RNA的鉴定及功能初探

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家蚕天然彩色茧分为黄红茧和绿茧两大类,是特色纺织原料。类胡萝卜素和黄酮类物质分别是黄红茧和绿茧的主要色素成分,这些天然色素的存在赋予天然彩色蚕丝抗菌、抗氧化等独特的优良性能。黄红色系蚕茧的色素只存在于丝胶中,绿色茧的色素在丝素和丝胶中均有分布,这使绿色茧丝具有独特的开发价值。对家蚕天然绿茧形成机制的研究,在揭示有关黄酮类物质在昆虫体内代谢和转运的理论基础上,可为绿茧的开发利用提供重要的指导。新绿茧(New Green Cocoon,Gn),是本小组发现的一种新的独立遗传绿茧。本研究小组前期对Gn位点进行了分子定位,并将Gn候选基因锁定为一簇糖转运蛋白编码基因(sugar transporter,str),该str簇成员均在Gn系中高量表达,而在对照白茧系中不表达或低表达,但其表达调控机制有待研究。大量的研究表明,lnc RNA在基因(包括基因簇)的表达调控中发挥着重要的作用。为了研究lnc RNA是否参与了str基因簇的表达调控及Gn的形成,我们对Gn定位区间内lnc RNA进行了鉴定筛选,发现在str基因簇附近存在一个lnc RNA,命名为lncstr-1。对lncstr-1的表达模式及序列进行了分析,并通过RNAi及转基因技术对其进行了功能的初步探究。本研究取得的主要结果如下:1.lncstr-1在Gn品系N100中的表达量显著高于其白茧亲本872B中肠、血淋巴、丝腺是绿茧色素积累过程中的关键组织,我们首先调查了五龄第3天,lncstr-1在Gn品系N100和白茧品系872B的中肠、血细胞、前中部丝腺、后部丝腺中的表达情况。发现lncstr-1在N100品系中肠、丝腺中表达量显著高于872B。我们进一步调查了lncstr-1在N100和872B四龄幼虫至蛾期的整个发育时期的表达量,发现在整个调查的幼虫期,lncstr-1在N100品系中的表达量明显高于白茧品系,在吐丝完全结束后(进入蛹期),lncstr-1在绿茧品系和白茧品系中表达差异缩小。该结果表明lncstr-1与str簇成员具有相似的表达趋势。2.lncstr-1基因组区域序列差异位点与绿茧性状高度关联利用RACE技术对lncstr-1的全长序列进行了分析,发现lncstr-1至少具有5种不同的剪切形式。进一步对lncstr-1在Gn品系及多个白茧品系中的序列进行分析、比对,发现lncstr-1基因组区域序列差异位点与绿茧性状高度关联,在调查的所有白茧品系中,lncstr-1 3’末端均发生大片段序列插入,通过进一步分析发现该插入片段为Bm SE转座子。3.str簇各成员的表达随着lncstr-1表达变化而变化为了验证lncstr-1是否对str簇成员具有表达调控功能,在五龄时期,我们在Gn品系家蚕体内注射lncstr-1靶si RNA,72 h后对lncstr-1进行表达检测,发现lncstr-1表达量显著上升,我们推测可能是检测时间过迟、体内产生反馈补偿所致,有待进一步试验。有趣的是,随着lncstr-1表达上调,各str基因的表达量也呈上升趋势,而lncstr-1附近的非str基因表达并未发生变化,该结果初步显示lncstr-1可能调节str基因簇的表达。为了实现lncstr-1更加有效、稳定的干涉,我们构建了lncstr-1反向互补序列过表达转基因系。在五龄起、五龄第3天、五龄第6天均取材检测了lncstr-1及str基因的表达情况,发现转基因系家蚕体内lncstr-1表达(正向、反向转录本的总量)表达量显著上调,而各str基因则呈现表达下调的趋势。该结果进一步表明lncstr-1可以调控str基因的表达。综上所述,本研究鉴定到Gn候选基因str簇附近的一个lnc RNA:lncstr-1,并初步揭示该lnc RNA可正向调控str簇的表达。这为进一步阐释Gn形成的分子机制提供了新的重要线索。
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