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目的:利用pGC-SPAG6-shRNA重组慢病毒载体在MDS细胞中靶向沉默SPAG6基因,明确SPAG6表达差异与PTEN的关系,从体内体外两方面探究SPAG6是否通过PI3K/AKT信号通路调控骨髓增生异常综合征(MDS)细胞凋亡,为MDS治疗探索新的靶点。方法:1.构建SPAG6-/-型SKM-1细胞模型:利用SPAG6-shRNA及NC-shRNA重组慢病毒载体,转染人MDS细胞株SKM-1细胞,流式细胞术检测病毒转染效率,荧光显微镜下观察细胞荧光表达,qRT-PCR检测mRNA表达水平,Western blot检测蛋白表达水平。2.探讨SPAG6在MDS细胞中对PTEN/PI3K/AKT信号通路活化的影响。流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测PTEN/PI3K/AKT通路相关蛋白表达。随后,利用PI3K/AKT抑制剂(Ly294002)和Caspase抑制剂(z-VAD-fmk)作用转染慢病毒的SKM-1细胞,Western blot检测PI3K/AKT通路相关凋亡蛋白表达。3.探索SPAG6在体内对MDS细胞凋亡的影响及机制:构建MDS荷瘤小鼠模型,检测小鼠体重及肿瘤生长情况。HE染色观察细胞形态,TUNEL法检测肿瘤组织细胞凋亡,Western blot及IHC检测体内相关凋亡蛋白表达情况。结果:1.成功构建SPAG6-/-细胞模型:显微镜下可见绿色荧光(GFP)大量表达,NC-shRNA及SPAG6-shRNA两组转染率结果分别为:91.81±3.04%及 82.54±1.42%,qRT-PCR及Westernblot结果表明SPAG6表达被成功抑制。2.靶向抑制SPAG6后,PTEN在mRNA和蛋白层面的表达上调,细胞凋亡增加;AKT表达无明显差异,p-AKT去磷酸化;Mcl-1和Bcl-2蛋白表达下调;细胞色素c释放,caspase9表达上调。慢病毒(SPAG6-shRNA)与PI3K/AKT抑制剂(Ly294002)共同处理细胞后,线粒体通路活化,细胞凋亡显著增加。而慢病毒(SPAG6-shRNA)与caspase抑制剂(z-VAD-fmk)同时处理细胞,caspase8表达被抑制后,PTEN活化不受影响,caspase 9/3表达增加。3.利用NOD/SCID小鼠成功构建MDS荷瘤小鼠模型,SPAG6干扰组SKM-1细胞在体内生长减缓,凋亡增加,细胞内外源通路可参与其中,与体外结果相一致。结论:SPAG6可通过抑制PTEN的表达,影响PI3K/AKT通路活化,从而调控SKM-1细胞的凋亡。