基质细胞蛋白SPARC对小梁功能的调控机制研究

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【目的】研究基质细胞蛋白SPARC对于人小梁细胞(HTMC)功能的调控机制。【方法】对于体外培养的原代人小梁细胞进行加压培养,培养压力分别为0、30、60 mm Hg,培养时间为0、24、48小时,QPCR检测富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(SPARC)、金属蛋白酶-15(MMP-15)、胞浆附着蛋白(ZO-1)的mRNA表达量变化;用FITC-Phalloidin染色观察HTMC中F-actin的分布变化。合成携带SPARC抑制基因的慢病毒pLshRNAmKate2-SPARC-543侵染HTMC,继续培养48小时后,QPCR检测SPARC、F-actin、ZO-1的mRNA表达量变化;western-bolt检测 SPARC、F-actin、ZO-1 蛋白表达量变化;FITC-Phalloidin 染色观察 HTMC 中 F-actin的分布变化;加入荧光乳胶微球颗粒,继续培养24小时后,荧光显微镜观察细胞吞噬情况的变化。【结果】HTMC体外加压0、30、60 mm Hg,持续培养0、24、48小时后SPARC-mRNA表达量在各时间点和各压力组间无显著差异;MMP-15-mRNA在30、60 mm Hg压力组,培养至24小时表达量较对照组下降,但继续培养至48小时后表达量基本恢复;ZO-1-mRNA仅在60mmHg压力组,48小时表达量较对照组下降;加压培养环境下HTMC细胞F-actin荧光染色表现为荧光弥散,结构模糊,呈现去极化分布。应用携带SPARC抑制基因片段的慢病毒pLshRNAmKate2-SPARC-543侵染HTMC,检测发现细胞SPARC、F-actin和ZO-1的mRNA和蛋白表达量较空白对照组(HTMC)和空白病毒对照组(HTMC-NC)均有显著下降;FITC-Phalloidin染色观察发现病毒组HTMC大部分细胞荧光弥散,骨架无法辨认,伪足生成,呈现明显的去极化分布;加入荧光乳胶微球颗粒,继续培养24小时后,荧光显微镜观察发现病毒组HTMC的吞噬能力增强。【结论】SPARC对于外界压力刺激并不敏感;下调SPARC通过减少HTMC细胞骨架相关蛋白(ZO-1、F-actin)的表达,导致细胞骨架重排和细胞吞噬能力增加,进而可能影响小梁房水外流功能。
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