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对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)是对虾暴发性流行病的主要病毒性病原,其基因组为双链超螺旋DNA病毒,基因组大小为300 kb,是目前发现的基因组最大的动物病毒。由于其独特的形态、生化特性和基因组结构,该病毒被国际病毒学命名委员会接受为一个新病毒科(Nimaviridae)新病毒属(Whispovirus)的唯一成员。依赖蛋白质组学技术,发现该病毒含有至少39个结构蛋白,以复杂的组装方式组装成病毒粒子。由于缺乏敏感细胞系,该病毒的基因功能研究滞后,只有少量有关结构蛋白定位和参与感染过程的研究结果。本论文首先对对虾白斑综合征病毒的核衣壳蛋白VP15核定位信号(NLS)的功能进行研究。序列分析发现它有4个核定位信号,通过与报告基因EGFP融合并在细胞中瞬时表达,对VP15全长、4个核定位信号序列以及部分缺失的VP15分别进行了细胞的定位分析。结果表明,VP15集中分布在细胞核内;VP15的第一个核定位信号具有核定位功能。但当第一个核定位信号缺失后,其他的核定位信号也会起作用,而且VP15核定位信号没有宿主特异性。
本文随后将WSSV病毒基因组中的3个含有细胞吸附序列的基因vp36A,vp36B和vp31利用载体pGEX-KG和pMAL-c2X在大肠杆菌中进行了克隆、原核表达、蛋白纯化与多克隆抗体制备。获得了大量可溶的纯化蛋白,所制备的三种抗体适合用做基因功能的进一步研究。利用Western-blot对VP36A进行了定位分析,并通过中和实验和细胞吸附实验对VP36A,VP36B和VP31进行了功能研究。Western-blot结果发现在完整的病毒粒子和囊膜成分中均显示一条约36kDa大小的蛋白带,因而鉴定VP36A是WSSV的一个新的囊膜蛋白。完整的病毒粒子被VP36A,VP36B和VP31的特异性抗体单独中和以及进行不同组合的中和后,对宿主的感染力明显下降,该结果显示VP36A,VP36B和VP31可能参与了病毒的侵染过程,其中VP36B和VP31抗体混合中和病毒后对宿主的保护能力几乎和全病毒的抗体对宿主的保护能力一样,说明这两个蛋白在病毒的侵染过程中起着非常重要的作用。但是,将纯化后的VP36B和VP31进行细胞吸附实验分析,并没有发现两个蛋白对血细胞的吸附能力;用合成的2个细胞吸附序列与病毒进行竞争实验,也没有发现这2个多肽有抑制病毒侵入的作用。