论文部分内容阅读
随着动物病毒感染人类导致严重公共卫生安全事件的频繁发生,病毒的种间传播即跨宿主传播——病原体跨越物种障碍从其原始宿主跳跃到新物种的现象,愈加引发病毒研究人员的关注。对虾病毒性偷死病(Viral covert mortality disease,VCMD)是由偷死野田村病毒(Covert mortality nodavirus,CMNV)引起的一种新发疫病,近年来使我国养殖对虾业遭受严重经济损失。为筛查水产养殖动物和养殖环境中CMNV自然宿主种类,本论文在研究养殖凡纳滨对虾感染CMNV的基础上,对养虾池塘中共生的虾虎鱼(Mugilogobius abei)、对虾养殖池塘排水渠中的鲫鱼(Carassius auratus)、对虾养殖废水池中养殖的黑鲷(Acanthopagrus schlegeli),以及北方重要养殖鱼类——牙鲆(Paralichthys olivaceus)等携带和感染CMNV的情况进行了调查,并利用逆转录环介导的等温扩增(RT-LAMP)、逆转录套式PCR(RT-nPCR)、组织病理学(H&E)、组织原位杂交(ISH)以及透射电子显微镜(TEM)等技术对自然感染CMNV的鱼类样品进行了分析。为进一步研究和确认CMNV对鱼类的感染性和致病性,本研究以模式生物——斑马鱼为实验对象,通过人工感染、分子生物学、组织病理、ISH和TEM等技术,对CMNV侵染斑马鱼的主要靶组织、组织病理变化,以及CMNV对斑马鱼的致病性和致死率进行了系统分析。1.对山东潍坊一养殖场疑患VCMD的凡纳滨对虾进行核酸检测、ISH、组织病理和TEM分析。RT-LAMP和荧光定量PCR方法检测结果均显示,该批对虾样品为CMNV阳性。组织病理分析表明,病虾肝胰腺小管上皮细胞细胞核明显固缩,细胞质中可见病毒包涵体,肌肉组织凝固状坏死,肌细胞间有血细胞浸润。原位杂交结果显示,该患病对虾肝胰腺和肌肉组织中均有CMNV阳性信号。TEM观测证实患病对虾肝胰腺中有大量CMNV样病毒颗粒。2.对采集自发生VCMD对虾养殖池塘中的虾虎鱼进行了分析。RT-nPCR检测结果显示该虾虎鱼样品呈现CMNV阳性。观测样品的组织切片发现,虾虎鱼眼睛中内核层变得稀疏,脑部组织中可见明显空泡化,神经细胞的细胞核固缩,肌肉组织呈轻微溶解样坏死且肌细胞间有血细胞浸润,脊柱神经组织内出现空泡化。ISH图片显示,上述呈现病变组织的切片中可见浅紫色CMNV杂交信号。上述结果表明,该虾虎鱼在自然条件下感染了CMNV,并导致重要组织器官发生了病理改变。3.在山东潍坊一发生VCMD的凡纳滨对虾养殖场排水渠中采集野生鲫鱼样品并进行了分析。RT-nPCR检测结果显示,鲫鱼样品的总RNA能扩增出与预期大小一致的CMNV RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)目标基因片段。组织病理和原位杂交分析显示,鲫鱼脑部神经组织空泡化严重,脑皮层锥体细胞和二叠体颗粒细胞的细胞核固缩明显,心肌呈现典型的溶解样坏死。脑和心肌组织的病变部位均可见淡紫色CMNV阳性杂交信号。透射电子显微镜观测显示,鲫鱼脑中可见神经组织空泡化,心肌组织坏死严重,CMNV样病毒颗粒占据了心肌细胞内大部分区域。该研究结果表明,CMNV在自然条件下能够跨越物种障碍,感染对虾养殖池塘排水渠中的野生鲫鱼并导致靶组织发生明显病理损伤。4.对浙江一发生VCMD对虾养殖场内养虾废水池中养殖的发病黑鲷进行了分析。RT-nPCR检测中该样品呈CMNV阳性。组织病理分析显示,患病黑鲷眼睛神经节细胞层中的细胞质空泡化明显、内核层稀疏,且与内丝状层衔接处界限变得模糊;脑神经组织中细胞空泡化明显;心肌组织呈现轻微的溶解样坏死,肌纤维排列疏松间隙变大,肌细胞间血细胞浸润现象明显;肝脏组织中,肝血窦扩张并出现严重的充血症状,肝细胞水肿肥大,细胞质空泡化,细胞核固缩明显;骨骼肌组织有溶解样坏死趋势。ISH分析结果显示,在患病黑鲷的眼睛、脑、心肌和肝脏组织切片中均可观察到浅/蓝紫色CMNV杂交信号。TEM观测发现,在黑鲷心肌和颗粒细胞中均可见散在的CMNV样病毒颗粒。上述结果证实,该患病黑鲷感染了CMNV,并且CMNV感染导致黑鲷的眼睛、脑等神经系统出现了严重的组织损伤,同时肝脏、心肌和肌肉也表现出不同程度的病理变化。5.山东胶南一养殖场养殖对虾检出CMNV感染后,对该养殖场不同养殖池塘内生长缓慢的牙鲆进行了采样和分析。RT-nPCR检测发现,所采集的45尾牙鲆中29%(13/45)的个体呈现CMNV阳性,RdRp靶基因测序和多重序列比对分析结果表明,牙鲆CMNV株的RdRp基因靶基因序列与CMNV原始株的相应片段序列高度保守。对患病牙鲆样品进行组织病理分析发现,牙鲆的眼睛和脑中神经组织空泡化明显,心肌广泛坏死。组织原位杂交结果证实,牙鲆的眼睛、脑、心脏、肝脏、脾脏和肾脏等组织中均有CMNV的阳性杂交信号。TEM分析发现,牙鲆的眼睛、心脏、肝脏、脾脏和肾脏组织中均可观察到CMNV样病毒颗粒的存在。6.以模式生物——斑马鱼为实验对象,对CMNV侵染斑马鱼的主要靶组织,组织病理变化,以及CMNV对斑马鱼的致病性和致死率进行了系统分析。斑马鱼腹腔注射CMNV后,感染组染病个体游泳行为出现异常,游动时身体失衡,呈螺旋状垂直或水平游动,部分染病个体的眼球异常突出,感染组7天内累计死亡率达48%。组织病理分析发现,染病斑马鱼眼睛视网膜、脑和肌肉等组织发生了明显的病理变化,包括眼睛视网膜和脑组织中出现空泡化,肌肉溶解样坏死,肌细胞间有少量血细胞浸润。对感染组斑马鱼进行组织原位杂交结果显示,染病斑马鱼的眼睛视网膜、脑和肌肉组织中均有CMNV阳性杂交信号。电镜下分析结果证实,人工感染CMNV的斑马鱼的脑和眼睛视网膜神经组织中有大量CMNV样病毒颗粒。本研究证实,CMNV可以通过腹腔注射的方式感染淡水种类斑马鱼,并导致斑马鱼眼、脑、肌肉和鳃等组织出现严重的病变及较高的死亡率。本论文有关CMNV自然感染凡纳滨对虾、虾虎鱼、鲫鱼、黑鲷和牙鲆的结果表明,CMNV在自然条件下能够跨越物种障碍,感染海水和半咸水鱼类,并导致感染个体靶组织明显的病理损伤;本研究人工感染模式生物斑马鱼实验中CMNV对斑马鱼的感染能力、致病性和致死性结果也提示,CMNV对其他养殖或野生鱼类的致病性和致死率也不容忽视。