【摘 要】
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海岛棉具有纤维长度、比强度、细度等优势,在农业生产、国民经济中具有很重要的地位。然而棉花枯萎病的蔓延严重地影响着海岛棉产量和品质,给农民的经济水平带来了负面的影响
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海岛棉具有纤维长度、比强度、细度等优势,在农业生产、国民经济中具有很重要的地位。然而棉花枯萎病的蔓延严重地影响着海岛棉产量和品质,给农民的经济水平带来了负面的影响。在分子水平上研究抗枯萎病基因的功能验证,为抗病分子育种提供功能明确的候选基因,是培育海岛棉抗枯萎病新品种和减少枯萎病危害的有效方法之一。本研究通过前期转录组测序和抗病表达谱数据,克隆了Gb LEA3、Gb PR10、Gb MPK16基因序列,并进行了生物信息学分析;利用枯萎病菌和乙烯、水杨酸诱导抗性不同的海岛棉品种,对克隆的抗病基因进行定量RT-PCR(q RT-PCR)表达分析;通过VIGS技术进行基因功能验证。取得的研究结果如下:1.根据前期转录组测序和抗病表达数据,从接种枯萎病菌的抗病海岛棉材料“06-146”中分别克隆了海岛棉同源基因序列,分别命名为Gb LEA3、Gb PR10、Gb MPK16,ORF序列长度分别为318bp、480 bp、1665 bp,氨基酸序列长度分别为105个、159个、554个,分别属于LEA-3、PR10、D组MAPK基因家族,相应的蛋白都属于亲水性蛋白,它们分布于线粒体、细胞质和细胞核中。结构域分析表明,Gb LEA3蛋白具有不同于LEA-3蛋白家族典型保守结构域,Gb PR10蛋白具有致病相关的Bet-v1功能区和核酸酶活性有关的甘氨酸环P-Loop(GXGGXG),Gb MPK16蛋白具有蛋白激酶(Protein-Kinase-Dom)结构域。生物信息学分析结果表明,Gb PR10、Gb MPK16这两个基因与植物抗病相关。2.枯萎病诱导的q RT-PCR表达分析表明,Gb MPK16基因在海岛棉抗病品种中,各个组织的表达量都高于感病品种,Gb LEA3和Gb PR10在不同品种的不同组织上的表达量不均匀,Gb PR10基因在抗病品种各组织的表达量较高于感病品种,说明枯萎病诱导Gb PR10和Gb MPK16基因的表达量明显上调。3.激素诱导的q RT-PCR表达分析表明,ET诱导后Gb LEA3基因在抗病品种4 h开始上调表达,而感病品种在各时期的表达量低于处理前的表达量;Gb PR10基因在抗病品种中出现先增后降趋势,而感病品种处理后期上调表达;Gb MPK16基因在抗、感病品种上逐渐上调表达。SA诱导后,Gb LEA3在抗病品种2 h、4 h逐渐上调表达,之后表达量快速下降,在感病品种上,除了4 h外,其它时期的表达量低于处理前的表达量;Gb PR10在抗病品种出现先上调后下调表达量趋势,而在感病品种上几乎没有表达;Gb MPK16基因在抗病品种2 h达到最高的表达量之后缓慢下降,而在感病品种表达量先增后降。结果表明,Gb LEA3、Gb PR10、Gb MPK16基因同一激素处理抗病品种的表达量明显高于感病品种。4.通过VIGS技术,对3个基因进行功能验证,并q RT-PCR鉴定发现,Gb LEA3、Gb PR10、Gb MPK16基因都沉默成功,Gb LEA3、Gb PR10基因的沉默率较高于Gb MPK16基因;枯萎病诱导15 d后的病情指数大小为Gb PR10:26.25>Gb MPK16:22.81>Gb LEA3:17.18>对照:15.93,说明对枯萎病抗性大小顺序为Gb PR10>Gb MPK16>Gb LEA3。推测Gb LEA3、Gb PR10、Gb MPK16基因都可能在抗枯萎病途径中发挥着重要作用。
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