论文部分内容阅读
睾丸支持细胞(Sertoli cell, SC)是影响精子生成的最重要的因素,SC与生精细胞数量比例保持恒定是生精细胞分化的一个重要条件,SC的数量决定了成年动物睾丸产生精子的数量。SC的增殖受多种因素的调节,在所有影响的激素和因子中,FSH是调节SC增殖过程最重要的激素之一,而Skp2是调节细胞增殖的关键性因子,能与发生泛素化的p27kipl结合,促使p27kipl在26S的蛋白酶体上发生降解,促进细胞进程。本研究拟以2-3周龄的仔猪为研究对象,以FSH调节Skp2的表达为核心,以培养的仔猪睾丸支持细胞为实验材料,通过添加各种信号通路的抑制剂,运用Western blot检测Skp2、p27kip]蛋白的表达,运用实时荧光定量PCR检测Skp2 mRNA的表达,为进一步认识促卵泡素调节睾丸支持细胞增殖的分子机制奠定基础。实验结果如下：(1)FSH促进了Skp2蛋白的表达,30min时,蛋白的量最大,此后Skp2的表达有所下降,到90min时,Skp2蛋白的表达量与对照相比无明显差异。同时FSH也促进了Skp2 mRNA的表达,加入FSH 15min后,Skp2 mRNA的表达明显增加,与对照组相比增加了11.56倍(P<0.05),在30min时,Skp2 mRNA表达量最高,是对照组的17.76倍(P<0.05),此后其表达水平有所下降。(2)加入cAMP的促进剂Forskolin(1OuM)与FSH一样均明显促进了Skp2蛋白的表达,抑制了p27kipl蛋白的降解；而cAMP的抑制剂Rp-cAMP (20 uM)单独作用时对Skp2、p27kip1蛋白的表达无明显影响,但抑制了FSH对Skp2、p27kip1蛋白的作用。(3)Ca2+通道抑制剂(Verapamil) (0.05mg/ml)单独作用时对Skp2、p27kip1蛋白的表达无明显影响,但抑制了FSH对Skp2、p27kipl蛋白的作用。FSH单独作用时细胞中Skp2 mRNA表达水平与对照组相比增加了7.14倍,加入Verapamil后细胞内Skp2 mRNA的水平有所下降,仅为FSH单独作用时的67.45%(P<0.05)。Verapamil单独作用时对于Skp2 mRNA的表达与对照组相比差异不显著(P>0.05)。(4)ERK的抑制剂U0126单独作用时对Skp2. p27kip1蛋白的表达无明显影响,但抑制了FSH对Skp2、P27kip1蛋白的作用。U0126对Skp2 mRNA的表达也无明显影响(P>0.05)但当U0126与FSH共同作用时Skp2 mRNA的表达明显下降,与FSH单独作用相比降低了53.0%(P<0.05)。综上所述,本实验可以得到如下结论：(1) FSH(50ng/ml)以时间依赖的方式促进了Skp2的表达,这一作用在30min时达到最佳效果；(2)FSH通过cAMP的产生和促进Ca2+的内流激活ERK1/2级联,并通过ERK1/2级联诱导Skp2 mRNA和蛋白的表达；(3)细胞中Skp2的水平与p27kipl的水平成负相关。