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芸薹属（Brassica）作物分布地区广，品种资源丰富，也是杂种优势利用最为普遍的一类作物，发掘和创建其雄性不育系，用于配制一代杂种，在生产实践中具有重要意义。花粉发育相关基因的分离及其功能分析，为深入探索白菜类等芸薹属作物花粉发育的分子机制提供了实验依据，同时有助于通过反义技术等阻断与花粉发育有关基因的表达从而获得雄性不育植株。本研究以白菜（Brassica campestris L．ssp．chinensis Markino，syn．B．rapa ssp．chinensis）花粉转录组的分析中发现的两个基因BcMF11（Brassica campestris male fertility gene 11）和BcMF12（Brassica campestris male fertility gene 12）作为研究对象，采用RACE（rapid amplification of cDNA ends）技术扩增分离基因全长，分析其序列特征并预测其蛋白质结构和功能，进而采用Northern杂交和RT-PCR（reverse transcriptase polymerase chain reaction）技术分析它们在白菜不同发育阶段的营养组织与生殖组织中的表达状况，然后依据反义遗传学原理，构建组成型启动子CaMV35S（Cauliflower mosaic virus 35S）和白菜绒毡层组织特异型启动子BcA9（Brassica campestris A9）驱动的反义BcMF11和反义BcMF12基因表达载体，通过遗传转化获得转基因植株，从分子、形态和细胞学等方面对转基因植株进行全面检测和分析，明确它们与白菜花粉发育的关系，为全面认识花粉发育的系统性调控，揭示芸薹属作物雄性不育的分子机理奠定基础。研究结果表明：（1）利用RACE技术从白菜野生型可育株中成功克隆到花粉特异的BcMF11（DQ925484）。该基因cDNA序列全长828 bp，多处出现终止密码子，缺乏明显的开放阅读框，但包含poly（A）尾部结构。碱基组成分析发现整个序列中A／T含量较高，达到58.7％。预测的RNA分子二级结构自由能非常低，只有-203.26 kcal·mol-1。BLAST搜索未发现与其相似的基因。推测BcMF11是白菜中首次发现的一个新的类似于mRNA的非编码RNA基因。该基因的上游序列区存在几个与花粉发育密切相关的顺式作用调控元件，预示BcMF11可能与花粉发育相关。Northern杂交与RT-PCR分析表明BcMF11在白菜的花蕾、开放的花及花药中特异表达，同时其转录本表达量随着花粉的发育保持缓慢增加，这说明BcMF11属于在花粉发育过程中持续表达的花粉特异基因。（2）根据白菜非编码RNA基因BcMF11的全长序列设计引物，在芸薹属植物的10个物种中PCR扩增得到BcMF11的同源序列。序列特征分析发现，这些BcMF11同源基因具有非编码RNA的共同特征，说明该非编码RNA基因在芸薹属植物进化过程中核苷酸序列较保守。在序列同源比对的基础上，基于Kimura双参数（2-parameter）距离，构建BcMF11同源基因在芸薹属植物10个物种的NJ（Neighbor-joining）系统树。结果表明，‘黄芽14’南方大白菜与‘油青’菜心聚为一类，与北方大白菜‘小青口’处于不同的分支，推测它与北方大白菜有不同的演化过程；而北方大白菜‘小青口’和‘温州盘菜’芜菁以极高的支持值聚为一类（BCL值为99％），成为它们亲缘关系很近的证据之一。（3）通过RACE方法从白菜花粉特异cDNA片段BBP1克隆到其全长基在BcMF12（DQ925483）。序列特征分析表明，该基因全长1155 bp，最大开放阅读框894 bp，编码297个氨基酸。对BcMF12编码的蛋白质二级结构预测表明它包含60.61％的螺旋和35.69％的环状结构。跨膜区及疏水结构分析表明该蛋白含有6个保守的疏水跨膜区，经BLAST查询发现它与植物中已报道的几个跨膜蛋白具有较高的相似性，因此BcMF12可能是白菜中一个新的跨膜蛋白。Northern杂交与RT-PCR分析表明BcMF12主要在白菜野生型可育株的中大蕾和大蕾中表达，属于花粉中特异表达的“晚”基因。（4）在正确分离反义BcMF11和反义BcMF12片段的基础上，分别构建了含有组成型启动子CaMV35S和花药绒毡层组织特异型启动子BcA9的反义RNA植物表达载体pBI35S-BcMF11、pBI35S-BcMF12、pBIBcA9-BcMF11和pBIBcA9-BcMF12，并通过“冻融法”将其导入农杆菌，根据已建立的高效白菜类作物遗传转化体系，利用农杆菌介导的方法将反义BcMF11和反义BcMF12表达载体导入菜心（B．campestrtis ssp．chinensis var．parachinensis Tsen et Lee）中，成功获得了61个KanR（kanamycin-resistant）转基因菜心芽系及305株菜心抗性植株。（5）对PCR筛选出的反义BcMF11和反义BcMF12转基因菜心阳性植株进行Southern和Northern印迹杂交检测，从整合及转录水平证明反义基因片段已成功转入菜心中，并有效抑制了转基因植株中内源基因的表达。X-Gluc组织化学染色结果也说明反义BcMF11和反义BcMF12片段在转基因菜心植株中进行了转录和表达。（6）对BcMF11反义基因菜心转化植株花器官的形态学观察发现其花丝短小，花药不饱满，而且部分花药颜色褐化，花粉数量极少，甚至无粉。花粉形态扫描电镜观察表明pBI35S-BcMF11和pBIBcA9-BcMF11菜心转基因株大部分花粉表现畸形，畸形率分别为88.59％和91.26％，极显著高于非转基因对照植株花粉的畸形率。采用组织化学方法对花粉发育及其形态的细胞学观察显示，转基因植株在花粉发育后期表现为花药瘪缩变形，花粉囊萎缩，花粉内含物消失，绒毡层细胞退化，花粉表现败育。花粉离体萌发试验结果显示，反义pBI35S-BcMF11和反义pBIBcA9-BcMF11转基因植株的花粉萌发率分别是31.35％和37.24％，均显著低于对照植株花粉的萌发率。由此推测，BcMF11沉默将使花粉形态和内部结构发生明显异常，最终导致花粉败育。（7）对反义BcMF12转基因菜心花器官的形态学观察发现其花药不饱满，颜色发白，花粉数量少。电镜扫描结果表明，反义pBIBcA9-BcMF12和反义pBI35S-BcMF12菜心转基因植株的花粉畸形率相差较大，分别为89.57％和23.42％；相应地，其花粉萌发率分别为38.26％和78.91％，说明BcA9启动子对反义BcMF12在花粉中表达的调控活性较之CaMV35S启动子的调控强。花粉体内萌发试验进一步表明反义BcMF12转基因植株的花粉和柱头的粘附过程不能正常进行，花粉管伸长速度减慢。因此推测BcMF12作为白菜花粉发育晚期特异表达的基因，在花粉萌发和花粉管的伸长过程中发挥重要作用。