论文部分内容阅读
目的:探讨miR-34a/STAT3/VAMP8调控血小板免疫活化的机制方法:（1）培养人成巨核细胞白血病细胞Meg-01,用1mmol/L双氧水（H2O2）刺激其2小时,模拟血小板氧化应激状态。实验分为2组,control组、H2O2组。q-RT-PCR检测各组细胞中miR-34a的表达水平;Western Blot（WB）检测各组细胞中CD62P、CD40L、PAC-1、VAMP8蛋白表达水平;（2）培养Meg-01细胞,向细胞内分别转染miR-34a的模拟物（mimic）和抑制物（inhibitor）48小时后,H2O2刺激2小时。实验分为4组,control组、H2O2组、miR-34a mimic+H2O2组、miR-34a inhibitor+H2O2组。透射电镜观察细胞内致密颗粒的变化。（3）培养Meg-01细胞,向细胞内分别转染miR-34a mimic、miR-34a inhibitor及其各自阴性对照,实验分为5组,control组、miR-34a mimic组、mimic control组、miR-34a inhibitor组、inhibitor control组。q-RT-PCR检测各组细胞中miR-34a、miR-96的表达水平;WB检测各组细胞中P-STAT3、STAT3、PAC-1、VAMP8蛋白表达水平。（4）利用靶基因预测网址Target Scan预测STAT3基因与miR-34a是否有结合位点,并用双荧光素酶报告基因验证STAT3是否是miR-34a的靶基因。（5）培养Meg-01细胞,向细胞内分别转染STAT3过表达质粒（CA-STAT3）、干扰片段（si-STAT3）及其各自阴性对照,实验分为5组,control组、CA-STAT3组、CA-control组、si-STAT3组、si-control组。q-RT-PCR检测各组细胞中STAT3mRNA、miR-96的表达水平;WB检测各组细胞中P-STAT3、STAT3、PAC-1、VAMP8蛋白表达水平。（6）培养Meg-01细胞,向细胞内分别转染miR-96 mimic、miR-96 inhibitor及其各自阴性对照,实验分为5组,control组、miR-96 mimic组、mimic control组、miR-96 inhibitor组、inhibitor control组。q-RT-PCR检测各组细胞中miR-96的表达水平;WB检测各组细胞中CD62P、PAC-1、VAMP8蛋白表达水平。（7）培养Meg-01细胞,向细胞内分别转染CA-VAMP8及si-VAMP8及其各自阴性对照,实验分为5组,control组、CA-VAMP8组、CA-control组、si-VAMP8组、si-control组。WB检测各组细胞中CD62P、PAC-1、VAMP8蛋白表达水平。结果:（1）H2O2刺激Meg-01细胞2小时后,与control组比较,H2O2能显著升高细胞内miR-34a、CD62P、CD40L、PAC-1、VAMP8蛋白表达水平（P<0.05）。（2）向细胞转染miR-34a mimic、miR-34a inhibitor及其各自阴性对照后,H2O2刺激2小时,透射电镜结果显示,H2O2组、H2O2+miR-34a mimic组中的致密颗粒数均比control、H2O2+miR-34a inhibitor组多,H2O2+miR-34a mimic组中的致密颗粒数多于H2O2组,control组、H2O2+miR-34a inhibitor组间致密颗粒数无明显变化。（3）向细胞转染miR-34a mimic、miR-34a inhibitor及其各自的阴性对照后,q-RT-PCR检测结果显示,miR-34a mimic组的miR-34a的表达高于control组和mimic control组（P<0.05）、miR-96的表达低于control组和mimic control组（P<0.05）;miR-34a inhibitor组的miR-34a的表达低于control组和inhibitor control组（P<0.05）、miR-96的表达高于control组和inhibitor control组（P<0.05）;control组、mimic control组、inhibitor control组间无显著差异（P>0.05）。WB结果显示,miR-34a mimic组P-STAT3蛋白的表达明显低于control组和mimic control组（P<0.05）,而STAT3蛋白的表达无显著差异（P>0.05）;miR-34a mimic组PAC-1、VAMP8蛋白的表达明显高于control组和mimic control组（P<0.05）,miR-34a inhibitor组P-STAT3蛋白的表达明显高于control组和inhibitor control组（P<0.05）,而STAT3蛋白的表达无显著差异（P>0.05）;miR-34a inhibitor组PAC-1、VAMP8蛋白的表达明显低于control组和inhibitor control组（P<0.05）。（4）靶基因预测网址TargetScan预测发现miR-34a-5p与STAT3 3’UTR区的2187-2193碱基序列有结合位点。双荧光素酶报告基因实验显示,与NC相比,转染了hsa-miR-34a-5p后,h-STAT3-MUT的报告荧光表达相对于h-STAT3-WT的报告荧光表达有明显的上升（P<0.05）。表明hsa-miR-34a-5p通过STAT3 3’UTR的结合位点靶向结合影响荧光素酶的活性,证实STAT3是miR-34a的靶基因。（5）向细胞转染CA-STAT3、si-STAT3及其各自的阴性对照后,q-RT-PCR检测结果显示,CA-STAT3组的STAT3 mRNA表达明显高于control组和CA-control组（P<0.05）;si-STAT3组的STAT3 mRNA表达明显低于control组和sicontrol组（P<0.05）。WB结果显示CA-STAT3组P-STAT3蛋白的表达明显高于control组和CA-control组（P<0.05）,而STAT3蛋白的表达无明显差异（P>0.05）;CA-STAT3组PAC-1、VAMP8蛋白的表达明显低于control组和CA-control组（P<0.05）;si-STAT3组P-STAT3蛋白的表达明显低于control组和si-control组（P<0.05）,而STAT3蛋白的表达无明显差异（P>0.05）;si-STAT3组PAC-1、VAMP8蛋白的表达明显高于control组和si-control组（P<0.05）。（6）向细胞转染miR-96 mimic、miR-96 inhibitor及其各自的阴性对照后,q-RT-PCR检测结果显示,miR-96 mimic组的miR-96的表达明显高于control组和mimic control组（P<0.05）,miR-96 inhibitor组的miR-96的表达明显低于control组和inhibitor control组（P<0.05）;WB结果显示,miR-96 mimic组CD62P、PAC-1、VAMP8蛋白的表达明显低于control组和mimic control组（P<0.05）,miR-96inhibitor组CD62P、PAC-1、VAMP8蛋白的表达明显高于control组和inhibitor control组（P<0.05）。（7）向细胞转染CA-VAMP8、si-VAMP8及其各自的阴性对照后,WB检测结果显示,CA-VAMP8组CD62P、PAC-1、VAMP8蛋白的表达明显高于control组和CA-control组（P<0.05）,si-VAMP8组CD62P、PAC-1、VAMP8蛋白的表达明显低于control组和si-control组（P<0.05）。结论:（1）在H2O2刺激下,miR-34a可促进Meg-01细胞免疫活化蛋白的表达。（2）miR-34a/STAT3/VAMP8可能调控血小板免疫活化功能。