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水稻是我国乃至世界的重要主粮作物之一,而病毒病的发生对东南亚水稻生产构成了严重威胁。在我国华南稻区,多种病毒病常常混合发生,其大面积的爆发流行,对我国水稻产量造成了严重损失。病毒检测是病害测报和防控的技术基础。本研究建立了同时检测华南稻区4种常见水稻病毒的多重RT-PCR检测体系,利用该技术监测了华南稻区病毒病的发生情况;在田间调查中发现了一种新的水稻病毒病,进而对该新病害的病原进行了鉴定,并着重研究了该病毒传播介体种类及其传毒特征,并初步鉴定了该病毒编码的RNA沉默抑制子。本文的主要研究结果如下:
1.明确了华南稻区4种主要病毒(SRBSDV、RRSV、RGDV和 RBSDV)的分布特点及发生情况。本研究根据4种病毒基因组特点,设计并筛选了针对不同病毒的特异性引物,并建立了多重RT-PCR检测方法。基于该方法,对2013-2015年间采自华南稻区的582个疑似病样进行了检测,检测结果表明,上述4种病毒在华南稻区均有分布,其中以RGDV为主,检出率为36.08%,随后依次为RRSV、SRBSDV和RBSDV,各占检测样品数的34.02%、30.07%和0.515%。进一步分析发现,4种病毒在华南稻区的分布存在明显的地理差异,海南南部以RRSV为主,广东西南部及东北部以RGDV为主,其它地区以SRBSDV为主,RBSDV仅在广西北部地区有发生。
2.发现并鉴定了一种新的水稻病毒:水稻条纹花叶病毒(Rice stripe mosaic virus, RSMV)。田间调查及人工接种观察揭示,该病毒引致水稻病害的症状主要表现为植株轻度矮化、叶片黄色条纹或花叶、部分叶片叶尖扭曲、抽穗不完整和籽粒空瘪。超薄切片电镜观察显示,感病水稻叶肉组织细胞质中存在大量具有包膜的杆状病毒粒体,其长300–375 nm,宽45–55 nm(n=50)。利用小RNA测序和RT-PCR技术获得了病毒全基因组序列,该病毒基因组为负义单链RNA,正义链编码7个ORFs,依次为N、P、P3、M、G、P6和L基因。对纯化的病毒粒体进行蛋白序列分析,结果表明N、P、M、G和L蛋白为病毒结构蛋白。进一步以病毒N、G和L基因编码产物氨基酸序列构建的进化树分析,结果显示该病毒为弹状病毒科细胞质弹状病毒属的一个新种,与CBDaV亲缘关系较近。该病毒可经电光叶蝉传播,自然条件下可侵染马唐草和鸭舌草。该病毒目前在广东西南部发生为害,部分田块病株率高达70%以上,对水稻造成了严重的产量损失。
3.明确了新病毒介体电光叶蝉的传毒特性。研究显示,无毒电光叶蝉成虫和若虫在病株上取食3 min后,就能获毒,且带毒率为19.2%(10/52)和24.4%(10/41)。成虫取食5 min、10 min和30 min,带毒率相差不大,分别为28%(14/50)、25.9%(14/54)和29.3%(12/41);若虫取食5 min和10 min的带毒率差异不大,分别为36.4%(12/33)和32.7%(17/52),但取食30 min后,带毒率明显升高,为45%(18/40)。成虫和若虫取食1 h后,带毒率分别达到了40.4%(21/52)和50%(15/30);而取食3 h后,介体带毒率明显提高,且若虫带毒率(66.7%)高于成虫(58.9%)。带毒电光叶蝉成虫和若虫,在健康稻苗上取食3 min、5 min和10 min,均不能使健康稻苗感病;取食30 min,可致5%(1/20)和15%(3/20)稻苗感病;取食1 h后,稻苗感病率分别达50%(12/24)和57.1%(16/28)。RSMV在虫体内的最短循回期为6天,最长的为18天,多数为10–16天,个体间差异显著。部分介体在病毒渡过循回期后,在生命结束之前可以持续带毒并传毒;部分带毒介体在传毒过程中存在间歇性,不传毒的间歇期最短为2天,最长为6天;少数带毒介体在死亡前不能传毒。
4.初步鉴定RSMV编码的P蛋白为RNA沉默抑制子。本文克隆了RSMV编码的6个基因全长序列(L基因除外),分别构建了植物表达载体,并转化农杆菌EHA105,与GFP表达载体共浸润转基因16c本氏烟。结果显示,RSMV编码的P蛋白具有较弱的局部抑制RNA沉默和延缓系统RNA沉默的活性。
本研究从病毒监测开始,明确了华南稻区主要病毒的发生情况及分布特点,为深入研究病害的发生规律及优化病害测报和防控技术体系提供了基础资料。RSMV的发现和鉴定及其介体传毒特征的研究,不但揭示了植物病毒在自然界中的多样性,而且及时发现了水稻新病原,为研发防控措施确保粮食生产安全打下了基础。
1.明确了华南稻区4种主要病毒(SRBSDV、RRSV、RGDV和 RBSDV)的分布特点及发生情况。本研究根据4种病毒基因组特点,设计并筛选了针对不同病毒的特异性引物,并建立了多重RT-PCR检测方法。基于该方法,对2013-2015年间采自华南稻区的582个疑似病样进行了检测,检测结果表明,上述4种病毒在华南稻区均有分布,其中以RGDV为主,检出率为36.08%,随后依次为RRSV、SRBSDV和RBSDV,各占检测样品数的34.02%、30.07%和0.515%。进一步分析发现,4种病毒在华南稻区的分布存在明显的地理差异,海南南部以RRSV为主,广东西南部及东北部以RGDV为主,其它地区以SRBSDV为主,RBSDV仅在广西北部地区有发生。
2.发现并鉴定了一种新的水稻病毒:水稻条纹花叶病毒(Rice stripe mosaic virus, RSMV)。田间调查及人工接种观察揭示,该病毒引致水稻病害的症状主要表现为植株轻度矮化、叶片黄色条纹或花叶、部分叶片叶尖扭曲、抽穗不完整和籽粒空瘪。超薄切片电镜观察显示,感病水稻叶肉组织细胞质中存在大量具有包膜的杆状病毒粒体,其长300–375 nm,宽45–55 nm(n=50)。利用小RNA测序和RT-PCR技术获得了病毒全基因组序列,该病毒基因组为负义单链RNA,正义链编码7个ORFs,依次为N、P、P3、M、G、P6和L基因。对纯化的病毒粒体进行蛋白序列分析,结果表明N、P、M、G和L蛋白为病毒结构蛋白。进一步以病毒N、G和L基因编码产物氨基酸序列构建的进化树分析,结果显示该病毒为弹状病毒科细胞质弹状病毒属的一个新种,与CBDaV亲缘关系较近。该病毒可经电光叶蝉传播,自然条件下可侵染马唐草和鸭舌草。该病毒目前在广东西南部发生为害,部分田块病株率高达70%以上,对水稻造成了严重的产量损失。
3.明确了新病毒介体电光叶蝉的传毒特性。研究显示,无毒电光叶蝉成虫和若虫在病株上取食3 min后,就能获毒,且带毒率为19.2%(10/52)和24.4%(10/41)。成虫取食5 min、10 min和30 min,带毒率相差不大,分别为28%(14/50)、25.9%(14/54)和29.3%(12/41);若虫取食5 min和10 min的带毒率差异不大,分别为36.4%(12/33)和32.7%(17/52),但取食30 min后,带毒率明显升高,为45%(18/40)。成虫和若虫取食1 h后,带毒率分别达到了40.4%(21/52)和50%(15/30);而取食3 h后,介体带毒率明显提高,且若虫带毒率(66.7%)高于成虫(58.9%)。带毒电光叶蝉成虫和若虫,在健康稻苗上取食3 min、5 min和10 min,均不能使健康稻苗感病;取食30 min,可致5%(1/20)和15%(3/20)稻苗感病;取食1 h后,稻苗感病率分别达50%(12/24)和57.1%(16/28)。RSMV在虫体内的最短循回期为6天,最长的为18天,多数为10–16天,个体间差异显著。部分介体在病毒渡过循回期后,在生命结束之前可以持续带毒并传毒;部分带毒介体在传毒过程中存在间歇性,不传毒的间歇期最短为2天,最长为6天;少数带毒介体在死亡前不能传毒。
4.初步鉴定RSMV编码的P蛋白为RNA沉默抑制子。本文克隆了RSMV编码的6个基因全长序列(L基因除外),分别构建了植物表达载体,并转化农杆菌EHA105,与GFP表达载体共浸润转基因16c本氏烟。结果显示,RSMV编码的P蛋白具有较弱的局部抑制RNA沉默和延缓系统RNA沉默的活性。
本研究从病毒监测开始,明确了华南稻区主要病毒的发生情况及分布特点,为深入研究病害的发生规律及优化病害测报和防控技术体系提供了基础资料。RSMV的发现和鉴定及其介体传毒特征的研究,不但揭示了植物病毒在自然界中的多样性,而且及时发现了水稻新病原,为研发防控措施确保粮食生产安全打下了基础。