狂犬病是由狂犬病病毒引起的人畜共患的烈性传染病,也是迄今为止人类病死率最高的急性传染病。抗狂犬病病毒单克隆抗体是研究狂犬病病毒诊断方法、治疗及预防狂犬病的有力工具。为了获得高效价、高特异性的抗狂犬病病毒的单克隆抗体,进而将其应用于开发一种方便、简单、廉价、技术要求低且适合基层使用的诊断方法,本研究用人用狂犬疫苗免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备得到针对狂犬病病毒的稳定的、效价高的、特异性强的单克隆抗体(mAb),并初步鉴定了杂交瘤和mAb的生物学特性,包括：杂交瘤的染色体、杂交瘤分泌抗体的稳定性、mAb的效价、亚类、纯度、蛋白浓度以及mAb的特异性。为开发简单实用的检测方法打下基础。一、融合条件的摸索在充分了解SP2/0细胞系的生长、增殖和遗传特性后,以聚乙二醇(PEG)诱导动物细胞融合,探索不同分子量、不同浓度的PEG作为融合剂对诱导SP2/0细胞与脾细胞融合的最适条件。结果表明分子量为4000,浓度为50%的PEG诱导的细胞融合率最高,为0.06429%,为下一步制备单克隆抗体奠定基础。二、单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备、筛选、克隆、稳定性及染色体1.抗体制备与细胞融合使用人用狂犬疫苗免疫雌性BALB/c小鼠,间隔2周免疫1次。双方阵法确定了间接ELISA法的最佳抗原包被浓度为1：80,阳性血清最适工作稀释度为1：400。间接ELISA法检测抗体效价达到104的3d后,通过PEG4000使免疫B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合。融合3-5d后出现杂交瘤细胞,7-10d后观察到杂交瘤细胞克隆生长。经HAT培养基选择培养后,细胞的融合率为82.99%。2.阳性克隆的筛选融合后14d左右,融合的杂交瘤细胞长到大约培养板的1/2面积时,按照已建立的间接ELISA法进行筛选,阳性克隆率为15.90%(38/239),选择OD值比较高的14株阳性杂交瘤细胞株进行亚克隆。3.阳性杂交瘤细胞的克隆化培养用显微操作法对阳性克隆的细胞株,分别进行了亚克隆,得到17珠分泌抗狂犬病病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名8F3、8F4、8G8、17A4、17A5、17A7、17B2、17B5、17B4、17C2、17C6、17D2、17D4、17D8、17E3、17E4、17F3。选择OD450值较高,生长状态良好的8F3、8F4、8G8、17B2、17E3、17E4、17F3进行扩大培养和鉴定,其它株冷冻保存。4.抗体分泌的稳定性检测将杂交瘤细胞连续培养传代,共传18代每隔3代检测一次细胞培养上清的抗体效价,结果显示6代以后杂交瘤进入稳定分泌抗体时期。5.杂交瘤细胞的染色体计数杂交瘤细胞染色体的平均数为94条,符合融合细胞染色体的特点。三、单克隆抗体的制备及初步鉴定1.mAb的制备通过收集培养上清、体内诱生腹水、制备实体瘤分离血清法获得并保存了8F3、8F4、8G8、17B2、17E3、17E4和17F3分泌的抗体。2.mAb的纯化经抗体亚类初步鉴定8F3、8F4、8G8、17B2、17E3、17E4、17F3所分泌的抗体类型皆属于IgG亚类,采用辛酸-硫酸铵法进行纯化。3.mAb的效价间接ELISA法检测培养上清、纯化和未纯化的腹水和实体瘤血清抗体效价。腹水和实体瘤血清中的抗体效价均高于104,最高的达1：128000,且腹水和实体瘤血清的效价比同种单抗细胞培养上清的效价均高100倍以上。4.mAb的亚类Ig类及亚类的鉴定结果显示8F3和8F4属于IgG2b,8G8和17E4属于IgG3、17B2属于IgG1,17E3和17F3属于IgG2a。5.mAb的纯度纯化后的单抗在50kD和25kD附近出现两条带,与预期的IgG抗体重链和轻链条带大小相符,而未纯化的单抗泳道上则出现多条杂带。6.mAb的蛋白浓度紫外分光光度法测得17B2、17E3、17E4、17F3、8F3、8F4、8G8、浓度分别为：1.6565mg/mL、0.0162mg/mL、0.0163mg/mL、1.7120mg/mL、1.6315mg/mL、1.6834mg/mL、0.0163mg/mL。7.mAb的特异性7株单克隆抗体与三个厂家的狂犬疫苗反应均为阳性,与犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬传染性肝炎病毒、犬副流感病毒、乙型肝炎病毒反应均为阴性。说明7株单克隆抗体的特异性强且与其他病毒无交叉反应。