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第一部分羧基化氧化石墨烯/煅烧骨的制备及理化性质的研究目的探讨羧基化氧化石墨烯/煅烧骨的制备方法,并评价其理化性质。方法通过改良Hummers法制备氧化石墨烯(GO),并将氧化石墨烯羧基化以制备羧基化氧化石墨烯(CGO),采用傅里叶红外光谱仪(FTIR)和X射线光电子能谱(XPS)对制备的CGO进行鉴定。制备0.5mg/ml、1mg/ml和2mg/ml的CGO悬浮液,将边长为5mm的煅烧骨(TBC)立方体浸入悬浮液中,通过超声复合2h和6h,分别制备0.5mg/ml-2h、1mg/ml-2h、2mg/ml-2h、1mg/ml-6h、2mg/ml-6h五种不同的羧基化氧化石墨烯/煅烧骨(CGO-TBC)。每个样品采用三维视频显微镜和场发射扫描电子显微镜(SEM)评价CGO在TBC材料表面的分布情况及CGO-TBC的表面形貌,选取最佳复合浓度和时间的CGO-TBC,并与TBC材料作比较测定其孔径、孔隙率、抗折压强度。结果通过FTIR和XPS检测,表明氧化石墨烯已成功羧基活化。三维视频显微镜和SEM对比五种不同CGO-TBC,选取1mg/ml-6h的CGO-TBC具有最佳CGO分布及表面纳米形貌。CGO-TBC的孔隙率和孔隙大小与TBC无明显差别,CGO-TBC的抗压和抗折强度较TBC更高。结论本实验成功制备CGO,并且TBC在1mg/ml的CGO悬浮液中超声复合6h可获得最佳CGO分布和材料表面形貌的CGO-TBC, CGO-TBC具有良好的表面形貌和孔隙结构,具有更好的生物力学强度。第二部分羧基化氧化石墨烯/煅烧骨的生物相容性以及载BMP2活性多肽pBMP2后体外控释的研究目的评价CGO-TBC的生物相容性,并负载BMP2活性多肽pBMP2以评价其在体外的药物释放动力学。方法制备CGO-TBC材料浸提液,采用浸提液进行急性毒性实验、微核实验、局部皮肤刺激实验、热原检查实验、溶血实验,并将材料植入肌袋进行肌袋植入实验,在CGO-TBC表面接种MC3T3-E1细胞,通过钙黄绿素/碘化丙啶染色,荧光显微镜下观察并评价材料的细胞相容性。将TBC和CGO-TBC分别负载BMP2活性多肽pBMP2,评价pBMP2在两种支架材料中的药物释放动力学。结果急性毒性实验未见大鼠大体观及脏器有明显异常,微核实验检测阴性,局部皮肤刺激未见明显水肿红斑,热原检查实验符合标准,溶血实验阴性,肌袋植入实验可见材料周围形成完整的纤维包膜,荧光显微镜下观察MC3T3-E1细胞存活良好,形态和分布正常。体外释放实验表明pBMP2在CGO-TBC内释放更加缓慢。结论CGO-TBC生物相容性良好,体外释放pBMP2较TBC材料更为缓慢,适宜作为一种骨修复支架材料和缓释药物载体。第三部分羧基化氧化石墨烯/煅烧骨对MC3T3-E1细胞的形态、粘附以及负载pBMP2后对细l胞增殖、分化的影响目的评价CGO-TBC与TBC对MC3T3-E1细胞粘附率、形态分布的影响,并负载pBMP2和rhBMP2后评价其对MC3T3-E1细胞增殖和成骨分化的影响方法将小鼠前成骨细胞MC3T3-E1种植在TBC和CGO-TBC表面,钙黄绿素/碘化丙啶染色后激光共聚焦显微镜下观察细胞形态、分布等情况,多聚甲醛固定后在场发射扫描电子显微镜下观察其在材料表面的形态和分布情况。通过间接计数法检测细胞在CGO-TBC和TBC表面的粘附率情况。将3mg的pBMP2或1μ g的rhBMP2负载在TBC和CGO-TBC表面,实验分为TBC组、CGO-TBC组、pBMP2/TBC组、pBMP2/CGO-TBC组、rhBMP2/TBC组、rhBMP2/CGO-TBC组,将MC3T3-E1细胞种植在材料上,采用MTT法检测MC3T3-E1细胞在不同材料上的增殖活性,通过检测碱性磷酸酶(ALP)活性来评价MC3T3-E1细胞在不同材料上的成骨分化活性结果钙黄绿素／碘化丙啶染色后在激光共聚焦显微镜下观察,可见TBC和CGO-TBC上的MC3T3-E1细胞形态正常,CGO-TBC上的细胞铺满支架小梁,排列较为有序。扫描电镜下观察可见细胞在小梁凹陷处分布较多,CGO-TBC上的细胞较TBC的细胞立体结构更为饱满。粘附率测定显示,CGO-TBC对细胞粘附率显著高于TBC组。MTT增殖和ALP活性测定显示,pBMP2能有效促进MC3T3-E1的增殖和成骨分化,CGO-TBC较TBC对细胞的增殖和分化具有一定的促进作用。结论CGO-TBC材料较TBC材料对细胞的形态、粘附具有一定的有利影响,在负载pBMP2后能作为一种骨诱导材料影响MC3T3-E1细胞的增殖和成骨分化,pBMP2可发挥类似BMP2的骨诱导作用。第四部分羧基化氧化石墨烯/煅烧骨负载pBMP2修复大鼠颅骨缺损模型的实验研究目的进一步评价pBMP2和CGO-TBC在大鼠颅骨临界骨缺损模型中修复骨缺损的能力和效果,探讨其在体内环境中对骨缺损修复的可行性和疗效。方法将TBC和CGO-TBC负载3mg的pBMP2或1μg的rhBMP2,植入大鼠颅骨临界骨缺损模型中观察成骨情况。实验分为6组：TBC组、 CGO-TBC组、pBMP2/TBC组、pBMP2/CGO-TBC组、rhBMP2/TBC组、rhBMP2/CGO-TBC组。将24只大鼠随机分为6组,制备直径5mm的大鼠颅骨临界骨缺损模型并植入上述材料,12W后行大体观、X线检查、CT三维重建和组织学切片HE染色评价骨缺损修复情况。结果12W后,TBC组和CGO-TBC组材料与宿主骨之间界限明显,材料大小无明显改变,CT三维重建显示缺损处凹陷明显,HE染色提示TBC组无明显新骨形成,CGO-TBC组在宿主骨边缘有少量新骨形成;pBMP2/TBC组和pBMP2/CGO-TBC组在X线下见材料周围低密度影界限较少,三维重建显示pBMP2/TBC组缺损凹陷明显,pBMP2/CGO-TBC组存在线状或点状凹陷,HE染色显示pBMP2/TBC组在宿主骨边缘附着少量新生骨,骨纤维排列混乱,pBMP2/CGO-TBC组可见宿主骨周围大量新骨形成,材料中央有新骨和类骨质形成；rhBMP2/TBC组和rhBMP2/CGO-TBC组材料与宿主骨之间界限模糊,材料大小减少明显,CT三维重建显示rhBMP2/TBC组存在线状或点状凹陷,rhBMP2/CGO-TBC组缺损处未见凹陷,HE染色显示rhBMP2/TBC组内可见宿主骨边缘和材料中央有新骨形成,骨纤维排列较为混乱;F组rhBMP2/CGO-TBC可见宿主骨边缘和材料中央有大量新骨形成,并出现板层化。成骨面积百分比显示,TBC组和CGO-TBC组成骨面积较小,较其他4组有明显差异(P<0.05), rhBMP2/CGO-TBC成骨面积最大,较其他5组有差异(P<0.05), pBMP2/TBC组、pBMP2/CGO-TBC组和rhBMP2/TBC组比较无明显差异(P>0.05)。结论CGO-TBC负载pBMP2后是一种较好的骨修复复合材料,具有一定的骨诱导活性,值得对其进行进一步研究。