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近年来,我国集约化奶牛场的高产奶牛在分娩后普遍处于能量负平衡状态,而这一状态诱发的卵巢静止（Inactive ovaries,IO）为主的乏情成为目前规模化奶牛场面临的主要繁殖障碍问题。研究表明,脑源性神经营养因子（Brain derived neurotrophic factor,BDNF）在卵泡的发育过程中扮演了重要的角色,但它在奶牛卵巢静止领域的研究还未见报道。因此,本研究将通过体内体外的四个试验,明确BDNF在奶牛产后能量负平衡引起的卵巢静止中所起的作用,为今后深入研究奶牛产后卵巢静止发生的分子机制和防治新策略提供科学依据。（1）BDNF与能量平衡和卵巢静止的关系。在黑龙江省某一规模化牧场选择120头2～3胎经产母牛,跟踪进行血液能量指标检测、临床疾病、发情及B超的检查,产后50天分为能量正平衡自然发情组（PEB-E,15头）和能量负平衡卵巢静止组（NEB-IO,15头）。通过两组奶牛繁殖性能、血液能量代谢指标、肝功指标和激素指标的独立样本T检验和单因素方差分析,结果显示:NEB-IO组奶牛繁殖性能下降,血液中E2、INS、IGF-1和LP显著降低,GH显著升高,表明NEB通过引起奶牛体内激素紊乱,进而引起IO。应用队列研究M-H?2检验两组奶牛产后20d能量负平衡与体内BDNF水平以及产后50d BDNF水平与卵巢静止之间的关系,结果显示:产后20d奶牛NEB与BDNF下降呈强正相关,产后50d血浆低水平BDNF与卵巢静止发生呈强正相关,表明NEB、低水平BDNF可以促进奶牛产后卵巢静止的发生。通过两组奶牛产后20d和50d血浆BDNF和Glu的ROC分析,结果显示:产后20d和50d的BDNF和Glu可以作为奶牛产后卵巢静止的预警指标,产后20d预警值为BDNF<1354.70 ng/L、Glu<2.48 mmol/L;产后50d预警值为BDNF<1421.77 ng/L、Glu<2.28 mmol/L。通过两组奶牛各3头的卵巢HE染色和FSH、BDNF与Trk B免疫组化试验,结果显示:NEB-IO组卵巢中发育异常的卵泡较多,三级卵泡的膜颗粒细胞层数明显降低,FSH、BDNF和Trk B在NEB-IO组明显减弱,表明低水平BDNF抑制了NEB-IO组奶牛卵泡颗粒细胞的增殖。（2）低糖条件下BDNF对奶牛颗粒细胞生长增殖和激素分泌的影响。以奶牛卵泡颗粒细胞为模型,通过Western blot检测正常和低糖培养基中BDNF和Trk B的表达水平,结合ELISA检测BDNF的分泌,结果显示:低糖培养卵泡颗粒细胞BDNF的表达和分泌都显著降低,而Trk B的表达没有差异,表明低糖降低卵泡颗粒细胞BDNF的表达和分泌。通过Western blot检测正常和低糖培养基中CCNA1、CCND1、CCNE2、CDK1、St AR和HSD3B1表达水平,结果显示:低糖培养的卵泡颗粒细胞细胞周期蛋白和类固醇激素合成蛋白的表达弱于普通培养,表明低糖抑制卵泡颗粒细胞增殖和激素分泌。应用CCK8、细胞计数、细胞周期试验以及培养基中E2和P4检测以确定正常和低糖培养基中BDNF的最佳添加剂量和时间,结果显示:100 ng/m LBDNF添加24h对卵泡颗粒细胞增殖和激素分泌的效果最好。通过细胞周期和CCK8检测正常和低糖培养中添加K252a和BDNF+K252a组卵泡颗粒细胞,结果显示:低糖和普通培养条件下,两组细胞S期比例和细胞活力极显著低于BDNF组（P<0.01）,表明BDNF通过其主要受体Trk B在低糖和普通培养条件下能够对奶牛卵泡颗粒细胞的增殖和活力发挥积极的作用。（3）低糖对BDNF通过PI3K/AKT信号通路促进卵泡颗粒细胞增殖和激素分泌的影响。应用Western blot检测LY294002（PI3K/AKT抑制剂）、K252a与BDNF对低糖培养的卵泡颗粒细胞AKT磷酸化水平,结果显示:LY294002、K252a均可以降低BDNF对AKT的磷酸化水平,表明BDNF通过Trk B激活PI3K/AKT通路。通过CCK8、细胞周期和Western blot检测低糖和普通培养的卵泡颗粒细胞中添加LY292004和BDNF后细胞的活力、细胞周期、细胞周期蛋白和类固醇激素合成蛋白的水平,结果显示:在低糖和普通培养条件下BDNF组细胞活力、细胞周期S期的比例极显著高于对照组、LY292004组和LY292004+BDNF组,BDNF组的细胞周期蛋白和类固醇激素合成有关蛋白的表达显著高于对照组,LY292004+BDNF组的细胞周期蛋白和类固醇激素合成有关蛋白的表达显著低于BDNF组,表明BDNF在低糖和普通培养条件下可以通过PI3K/AKT促进颗粒细胞增殖和类固醇激素的分泌。（4）低糖对BDNF通过MAPK/ERK信号通路促进卵泡颗粒细胞的增殖和激素的分泌的影响。应用Western blot检测PD98059（MAPK/ERK抑制剂）、K252a与BDNF对低糖培养的卵泡颗粒细胞ERK1/2磷酸化水平,结果显示:PD98059、K252a均可以降低BDNF对ERK1/2的磷酸化水平,表明BDNF通过Trk B激活MAPK/ERK通路。通过CCK8、细胞周期和Western blot检测低糖和普通培养的卵泡颗粒细胞中添加PD98059和BDNF后细胞的活力、细胞周期、细胞周期蛋白和类固醇激素合成蛋白的水平,结果显示:在低糖和普通培养条件下,BDNF组细胞活力、细胞周期S期的比例极显著高于对照组、PD98059组和PD98059+BDNF组,BDNF组细胞周期蛋白和类固醇激素合成有关蛋白的表达显著高于对照组,PD98059+BDNF组的细胞周期蛋白和类固醇激素合成有关蛋白的表达显著低于BDNF组,表明BDNF在低糖和普通培养条件下可以通过MAPK/ERK促进颗粒细胞增殖和类固醇激素的分泌。结论:本研究在获得奶牛产后卵巢静止的血液临床病理学特征基础上,确立能量负平衡、低水平BDNF是奶牛卵巢静止高发的危险因素和血中BDNF和Glu作为卵巢静止发生的预警指标,证实BDNF-Trk B可以通过PI3K/AKT、MAPK/ERK二个途径促进颗粒细胞增殖和类固醇激素的分泌,为今后深入揭示奶牛产后卵巢静止发生的分子机制和防治提供了新的方向。