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第一部分IL-17C在异基因造血干细胞移植后a GVHD中的作用目的:探究IL-17C在异基因造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病(acute GVHD,a GVHD)中的作用。方法:本实验采用BALB/C(H-2d)小鼠,野生型(WT)C57BL/6(H-2b)小鼠和C57BL/6(H-2b)IL-17C基因敲除(IL-17C-/-)小鼠作为供体,BALB/C(H-2d)小鼠作为受体。受体BALB/C小鼠接受全身致死性辐照(X-Ray,6.5 Gy),分别移植BALB/C(H-2d)小鼠和野生型C57BL/6(H-2b)小鼠来源的1×107个骨髓细胞和5×106个脾细胞。辐照分两次进行,每次3.25Gy,两次辐照间隔4小时,以缓解胃肠道辐照毒性。移植后第0,3,7,12天取小鼠的脾、肝、肺、小肠组织,提取RNA并逆转录为DNA。Real-time PCR检测小鼠移植后各靶器官中IL-17C的相对表达量。受体BALB/C小鼠接受全身致死性辐照(X-Ray,6.5 Gy),分别移植野生型C57BL/6小鼠和IL-17C-/-小鼠来源的1×107个骨髓细胞和5×106个脾细胞。观察小鼠生存并对a GVHD发病进行病理评分。移植后14天,收集小鼠肝、肺、小肠和皮肤,通过H&E染色进行病理组织学分析。受体BALB/C小鼠接受全身致死性辐照(X-Ray,6.5 Gy),分别移植野生型C57BL/6小鼠来源的1×107个骨髓细胞和5×106个脾细胞,IL-17C-/-小鼠来源的1×107个骨髓细胞和5×106个脾细胞,野生型C57BL/6小鼠来源的1×107个骨髓细胞和IL-17C-/-小鼠来源的5×106个脾细胞,IL-17C-/-小鼠来源的1×107个骨髓细胞和野生型C57BL/6小鼠来源的5×106个脾细胞。观察并记录移植后小鼠的生存情况。结果:(1)与同基因移植相比,异基因移植后IL-17C的表达量相对较低。在脾和肺中,IL-17C受体IL-17RE的表达也有降低的趋势。(2)供体IL-17C基因敲除能显著加重a GVHD的发病,促进a GVHD相关死亡。肝、肺、小肠和皮肤的病理损伤也较对照组严重。(3)在小鼠急性移植物抗宿主病中,输注IL-17C-/-小鼠来源的骨髓细胞与脾细胞的受体最快死亡,而输注WT小鼠来源的骨髓细胞与脾细胞的受体生存最久。输注IL-17C-/-小鼠来源的骨髓细胞和WT小鼠来源的脾细胞与输注WT小鼠来源的骨髓细胞和IL-17C-/-小鼠来源的脾细胞的受体生存介于两者之间。结论:与同基因移植相比,IL-17C的表达量在异基因移植后降低。IL-17C基因敲除显著加重a GVHD的发病进程并缩短小鼠生存。骨髓细胞来源与脾细胞来源的IL-17C在小鼠急性移植物抗宿主病中都具有保护作用。第二部分IL-17C保护异基因造血干细胞移植后a GVHD的机制目的:探究IL-17C调节异基因造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病(acute GVHD,a GVHD)的机制。方法:本实验采用野生型(WT)C57BL/6(H-2b)小鼠和C57BL/6(H-2b)IL-17C基因敲除(IL-17C-/-)小鼠作为供体,采用BALB/C(H-2d)小鼠作为受体。受体BALB/C小鼠接受全身致死性辐照(X-Ray,6.5 Gy),分别移植野生型C57BL/6小鼠和IL-17C-/-小鼠来源的1×107个骨髓细胞和5×106个脾细胞。辐照分两次进行,每次3.25Gy,两次辐照间隔4小时,以缓解胃肠道辐照毒性。移植后2周取小鼠脾脏、肝脏、肺和小肠的淋巴细胞,通过流式染色检测各靶器官中异基因T细胞反应。构建过表达IL-17C的质粒,在移植前3天通过高压水流动力学的方法尾静脉分别输注空载质粒和过表达IL-17C的质粒,然后移植IL-17C-/-小鼠来源的1×107个骨髓细胞和5×106个脾细胞。观察小鼠生存。移植后2周取小鼠脾脏、肝脏、肺和小肠的淋巴细胞,通过流式染色检测各靶器官中异基因T细胞反应进一步明确IL-17C在移植物抗宿主病中的作用及其对T细胞反应的调节功能。FITC-Dextran灌胃检测移植后小鼠的肠道通透性。采集小鼠小肠组织,提取RNA并逆转录为DNA。利用Real-time PCR检测肠道炎症因子IFN-γ,IL-6,IL-1β和TNF-α的表达。通过过表达IL-17C进一步明确IL-17C对肠道通透性以及肠道炎症的影响。在移植后2周,检测WT和IL-17C-/-受体小鼠体内各GVHD靶器官中调节性T细胞(Regulatory T cell,Treg)的比例。通过过表达IL-17C进一步明确IL-17C对调节性T细胞的影响。体内Ed U增殖实验检测IL-17C对调节性T细胞增殖的作用。在体外实验中,通过CD3/CD28刺激和异基因刺激分别检测IL-17C对调节性T细胞分化的影响。利用CD25抗体清除供体来源的调节性T细胞,检测IL-17C调节的移植物抗宿主病是否通过调节性T细胞依赖的途径而发挥作用。结果:(1)与移植WT骨髓的受体鼠相比,IL-17C-/-受体小鼠脾脏和肺中的CD4+和CD8+T细胞活化显著升高。(2)IL-17C-/-受体小鼠内分泌IFN-γ的CD4+和CD8+T细胞的比例和数目显著增加。(3)过表达IL-17C能显著延长小鼠的生存。(4)过表达IL-17C能显著抑制CD4+和CD8+T细胞的活化。(5)过表达IL-17C能显著抑制CD4+和CD8+T细胞分泌的IFN-γ。(6)IL-17C-/-受体小鼠肠道通透性增加且分泌的炎性因子IFN-γ和IL-6上调。(7)过表达IL-17C后,小鼠肠道通透性降低。小鼠肠道分泌的炎性因子IFN-γ和IL-6降低。(8)IL-17C-/-受体小鼠内调节性T细胞的比例降低,而过表达IL-17C之后升高。(9)IL-17C基因敲除后调节性T细胞的增殖减少,体外分化实验也证明IL-17C KO中Treg细胞的分化受到抑制。(10)清除供体来源的调节性T细胞之后,IL-17C对移植物抗宿主病的抑制作用消失。结论:供体IL-17C基因敲除促进CD4+和CD8+T细胞的活化及其炎性因子IFN-γ的分泌,而过表达IL-17C能抑制异基因T细胞反应。此外,IL-17C还能通过维持肠道通透性和抑制肠道炎症而减轻移植物抗宿主病。体内外实验均表明,IL-17C对Treg细胞的分化有促进作用。IL-17C通过调节性T细胞依赖的方式抑制移植物抗宿主病。第三部分IL-17C在临床异基因造血干细胞移植后a GVHD中的预测价值目的:检测造血干细胞移植患者中IL-17C的表达量,分析其临床意义及与移植物抗宿主病的相关性。方法:本实验中我们收集2012年在苏州大学附属第一医院进行移植的68例造血干细胞移植患者的血清及临床数据。采用酶联免疫吸附实验检测IL-17C的表达量,并统计分析其临床意义。结果:(1)IL-17C在II-IV度急性GVHD患者体内表达量较0-I度患者低,但在发生慢性GVHD和未发生慢性GVHD患者体内无显著差别。(2)IL-17C对II-IV度急性GVHD的发生具有较好的预测价值(AUC=0.668,95%CI=0.535-0.802,P=0.019)。(3)IL-17C高表达组(IL-17C≥106.32 pg/ml)中II-IV度急性GVHD的发生率显著低于低表达组(P=0.006)且生存相对较长(P=0.086)。(4)单因素分析发现,低水平的IL-17C的表达量(HR=3.974,95%CI=1.391-11.356,P=0.010)和高危疾病状态(HR=3.000,95%CI=1.022-8.810,P=0.046)与II-IV度急性GVHD的发生相关。(5)多因素分析发现,低表达IL-17C(IL-17C<106.32 pg/ml)是预测II-IV度急性GVHD的发生的最强危险因素(HR=1.480,95%CI=0.276-12.003,P=0.012)。结论:患者移植前血清中IL-17C的表达量可以预测造血干细胞移植后患者II-IV度急性GVHD的发病率。