论文部分内容阅读
目的:与爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus,EBV)相关的胃癌,即EB病毒相关胃癌(Epstein-Barr virus-associated gastric cancer,EBVaGC)约占胃癌的近10%,由于胃癌在世界范围内的高发病率和病死率,EBVaGC发病的绝对数高,每年新发病例在90000以上,因此对EBVaGC发生机制以及其相关基因的研究具有重要意义。然而,迄今为止在EBV相关肿瘤中尚未见EBV潜伏膜蛋白2A(EBV-encoded Latent Membrane Protein 2A,LMP2A)与环氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)之间相关性的研究报道。EBV编码的潜伏膜蛋白1(EBV-encoded Latent Membrane Protein 1,LMP1)在EBVaGC中是否与COX-2相互作用也需要进一步研究。方法:(1)采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)检测3种EBV阳性胃癌细胞系(GT38,GT39以及SNU719)和5种EBV阴性胃癌细胞系(SGC7901,BGC823,AGS,HGC27以及MKN45)中COX-2表达水平是否存在差异。(2)重亚硫酸氰盐测序(Bisulfite Genomic Sequense,BSP)检测EBV阳性胃癌细胞系和EBV阴性胃癌细胞系中COX-2基因启动子区甲基化水平。(3)qRT-PCR方法检测靶向COX-2编码基因的几种microRNA的转录表达。(4)采用Western Blot方法检测EBV阳性胃癌细胞系和EBV阴性胃癌细胞系中COX-2和TRAF2(Tumor necrosis factor receptor-related factor 2)蛋白表达水平。(5)以pcDNA3.1分别构建LMP1和LMP2A编码基因的重组表达质粒,分别转染EBV阴性胃癌细胞系SGC7901,筛选出相应的细胞克隆,观察外源性LMP1和LMP2A表达对COX-2和TRAF2表达的影响。(6)采用小干扰RNA技术(Small Interfere,siRNA)分别靶向干扰EBV阳性胃癌细胞系GT38中LMP1和LMP2A编码基因的表达,观察两种蛋白表达沉默对COX-2和及TRAF2的影响。(7)在EBV阴性胃癌细胞系SGC7901中用采用两种不同序列的siRNA靶向作用TRAF2编码基因,观察干扰后TRAF2的蛋白表达选择干扰效果好的序列,以确保其对COX-2蛋白下调作用的准确性。(8)采用MEK抑制剂PD0325901和si-ERK1/2阻断EBV阴性胃癌细胞系SGC7901中ERK通路,检测分析p-ERK是否参与LMP1对COX-2的调控。(9)EBV能够激活PI3K/AKT通路,采用PI3K抑制剂LY294002阻断EBV阳性细胞系GT38中AKT通路,研究p-AKT在EBV对COX-2调控中的角色。(10)采用si-Fox O1干扰EBV阴性胃癌细胞系SGC7901中Fox O1的表达,检测COX-2 mRNA和蛋白表达的变化。结果:(1)COX-2在3种EBV阳性胃癌细胞系中m RNA转录表达水平明显低于5种EBV阴性胃癌细胞系(t=10.3,P=0.0005)。(2)EBV阳性胃癌细胞系和EBV阴性胃癌细胞系中COX-2基因启动子区甲基化水平分别为4.12%和11.42%,统计学分析结果显示,EBV阳性胃癌细胞系中COX-2基因启动子区甲基化水平明显低于EBV阴性胃癌细胞系(t=2.58,P=0.04)。(3)EBV阳性胃癌细胞系和EBV阴性胃癌细胞系中COX-2蛋白表达具有明显差异,统计学分析结果显示,EBV阳性胃癌细胞系中COX-2蛋白表达水平明显低于EBV阴性胃癌细胞系(t=6.075,P=0.0017)。(4)EBV阴性胃癌细胞系SGC7901中外源性LMP1或LMP2A表达染可显著降低COX-2和TRAF2蛋白表达水平;而干扰EBV阳性胃癌细胞系GT38中LMP1或LMP2A表达,则COX-2和TRAF2蛋白表达则有所恢复。(5)干扰EBV阴性胃癌细胞系SGC7901中TRAF2表达,可观察到COX-2蛋白表达的急剧下降。(6)此外,在AGS中过表达LMP1使得ERK激活减少(t=7.49,P=0.01),使用MEK抑制剂及si-ERK1/2鉴定ERK的阻断下调了COX-2的蛋白表达(P<0.01)。(7)在GT38中使用了PI3K抑制剂LY294002后发现其下游的转录因子FoxO1以及COX-2的表达均有恢复,并且在SGC7901中抑制FoxO1则降低了COX-2的产生(t=3.68,P=0.02),因此鉴定出Fox O1参与了p-AKT对COX-2的抑制作用。结论:(1)在EBV阳性胃癌细胞中,外源性LMP1和LMP2A表达可通过下调TRAF2抑制COX-2表达。(2)而p-ERK参与了LMP1对COX-2的抑制。(3)观察到EBVaGC细胞中可以通过激活AKT通路磷酸化FoxO1降低COX-2的转录。