论文部分内容阅读
目的:DNAshuffling技术可以定向进化干扰素，获得比rhIFN-α2b标准品更高比活的干扰素。本实验利用DNase(I)酶切、无引物PCR、有引物PCR、目的基因与克隆基因pUC19连接、双酶切鉴定，转化至DH5α感受态细胞、阳性克隆的筛选、测序正确的基因与表达载体pET30a连接、转化至BL21(DE3)感受态细胞以及诱导表达目的蛋白、细胞裂解、包涵体的纯化、洗涤与裂解、目的蛋白的纯化测活等一系列技术手段获得比rhIFN-α2b更高比活的干扰素。方法:rhIFN-α2b基因与Infergen基因用DNase(I)酶切成30-50bp小片段，回收之后进行无引物PCR重聚和有引物PCR扩增基因。将重组基因连接到载体pUC19中，转化至DH5α并挑选阳性克隆测序。将测序正确的突变基因连接到载体pET30a中并转化至BL21(DE3)中，诱导蛋白表达、SDS-PAGE凝胶电泳和Westernblot分析。经过表达细胞诱导、细胞裂解、包涵体变性、复性和单克隆抗体亲和层析之后，最后获得高纯度与高活性的重组干扰素。结果:把10个连接到pUC19载体上的基因片段通过测序显示7段载体上的基因没有发生改变，分别是5段Infergen基因和2段rhIFN-α2b基因。3段基因序列发生了改变，包括2段基因发生了移码突变，1段基因为正常突变干扰素基因，对重组基因表达的干扰素测活得到的比活值为5.8×108IU/mg，而rhIFN-α2b标准品比活大约为1.2×108IU/mg，比活结果提高近5倍。结论:实验结果证明利用DNAshuffling的实验方法来提高干扰素的比活是确实可行的，利用此技术可以获得比标准品更高比活的干扰素。这个结果也对利用DNAshuffling技术进行其他蛋白质的定向进化提供了一定的理论基础。