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猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)是引起以断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)为代表的猪圆环病毒相关疾病(porcine circovirus associated disease,PCVAD)的主要病原。PCV2感染可引起机体免疫抑制,使机体对多种病原易感,继发多个病原的混合感染,同时使多种疫苗对猪的保护性降低甚至消失,导致感染猪的病死率显著升高,给养猪业造成巨大的经济损失。单核巨噬细胞作为机体防御病原入侵和向免疫系统呈递病原信息的主要细胞,可被PCV2感染,且PCV2能长期存在于此类细胞的细胞浆内,影响其抗微生物活性。PCV2这种可以与单核巨噬细胞长期共存的方式为PCV2逃避机体免疫识别并在宿主体内复制和致病提供了良好的途径,但是PCV2通过何种机制调控巨噬细胞的功能活性,目前仍不清楚。本论文通过感染性克隆的方法从自然感染的PMWS仔猪体内分离获得PCV2毒株,而后将其感染猪肺泡巨噬细胞,研究PCV2感染猪肺泡巨噬细胞后调控白介素-10(interleukin-10,IL-10)和白介素-12p40(interleukin-12p40,IL-12p40)表达的动力学特征和调控机制,初步探讨了PCV2相互作用分子在这一过程中的作用与调控机制。研究取得如下结果。1.从自然感染PCV2的PMWS猪组织DNA中PCR获得2株PCV2病毒(SXXY和SXBJ)的全基因组,基因型鉴定分别为PCV2a和PCV2b基因型;PCV2全基因组体外环化后转染PK-15细胞,连续传代5次后获得了具有感染性的2株PCV2毒株。2.PCV2 ORF1、ORF2和ORF3编码基因克隆入原核表达载体pET-32a,转化大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测显示正确表达了大小约为52 KDa、39KDa和29 KDa的PCV2 Rep、Cap和ORF3蛋白;回收表达的蛋白,分别免疫新西兰大白兔,分离抗血清,纯化抗PCV2 Rep、Cap和ORF3蛋白的多克隆抗体,western blotting检测显示制备的PCV2 Rep、Cap和ORF3蛋白多克隆抗体特异性良好,效价均高于1:10000。3.PCV2 ORF1、ORF2和ORF3编码基因克隆入腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV,Pme I单酶切线性化后电转化含有pAdeasy-1的BJ5183感受态细胞,筛选重组腺病毒质粒,Pac I单酶切线性化后转染293A细胞,分别获得表达PCV2 Rep、Cap和ORF3蛋白的重组腺病毒,RT-PCR和western blotting检测显示重组腺病毒正确表达大小约为52 KDa、39 KDa和29 KDa的PCV2 Rep、Cap和ORF3蛋白。4.PCV2和PCV1分别感染猪肺泡巨噬细胞,ELISA和双荧光素酶活性检测显示,与PCV1相比,PCV2感染能显著诱导猪肺泡巨噬细胞表达IL-10(p<0.01);Q-PCR检测显示,PCV2感染早期(0.5~3 h)和后期(12 h)均显著上调IL-10 mRNA水平(p<0.05,p<0.01),且后期水平显著高于早期(p<0.05);western blotting和ChIP检测显示,PCV2感染早期激活p50/p50介导的NF-κB和Akt1介导的PI3K/Akt信号通路,后期进一步激活p38 MAPK和ERK信号通路,而PCV1仅能在感染后期激活NF-κB信号通路,对其它信号通路没有活化作用。通过表达PCV2 Rep、Cap和ORF3蛋白的重组腺病毒感染猪肺泡巨噬细胞,结果显示Cap和Rep能够诱导IL-10表达(p<0.01),而ORF3不具有诱导IL-10表达的功能,但是在PCV2感染诱导IL-10表达的时间内并未检测到Rep蛋白的表达。western blotting检测显示Cap蛋白能够激活PI3K/Akt、ERK和p38 MAPK信号途径。通过siRNA或CRISPR/Cas9方法下调或敲除宿主细胞中Cap相互作用分子gC1qR则显著抑制PCV2诱导的PI3K/Akt和p38 MAPK信号途径的活性,进而部分或完全地抑制PCV2诱导的IL-10产生(p<0.05,p<0.01)。5.PCV2感染仔猪后灌取肺泡巨噬细胞,流式细胞术检测显示,PCV2感染仔猪中CD68阳性的肺泡巨噬细胞占总细胞的55.3%,而对照组中占87.6%。流式细胞术检测显示,PCV2感染仔猪2周后巨噬细胞M2型标记分子CD206的表达显著上调(p<0.05),感染4周后极显著上调(p<0.01),而CD163的表达无显著变化。Q-PCR检测显示,PCV2感染猪肺泡巨噬细胞中M1型标记分子mRNA水平极显著降低(p<0.01),M2型标记分子mRNA水平显著上调(p<0.05,p<0.01)。流式细胞术检测显示PCV2感染体外培养的原代猪肺泡巨噬细胞中M2型标记分子CD163和CD206表达均极显著上调(p<0.01)。流式细胞术和Q-PCR检测显示,PCV2感染猪肺泡巨噬细胞在转录和转录后水平均显著抑制由LPS/IFN-γ诱导的IL-12p40表达(p<0.05);Q-PCR筛选与IL-12p40转录后调控相关的miRNAs,结果显示在PCV2感染的巨噬细胞中miR-23a/b表达显著上调(p<0.01,p<0.05),miR-23a/b mimics可在转录后水平抑制LPS/IFN-γ诱导的IL-12p40表达(p<0.05),而miR-23a/b inhibitor可减弱PCV2对LPS/IFN-γ诱导的IL-12p40表达的抑制作用(p<0.05)。本研究成功分离了2株PCV2毒株,制备了抗PCV2 Rep、Cap和ORF3蛋白的多克隆抗体,构建了表达PCV2 Rep、Cap和ORF3的重组腺病毒。进一步研究表明,PCV2通过激活p50/p50介导的NF-κB通路、Akt1介导的PI3K/Akt通路、p38 MAPK和ERK信号通路诱导猪肺泡巨噬细胞高表达IL-10,PCV2 Cap相互作用蛋白gC1qR是介导PCV2激活PI3K/Akt和p38 MAPK通路并诱导IL-10高表达的关键细胞内调控分子。PCV2感染可诱导巨噬细胞向M2型极化,并通过上调miR-23a/b表达,进而在转录后水平抑制LPS/IFN-γ诱导的IL-12p40表达。研究结果阐明了PCV2诱导猪肺泡巨噬细胞表达IL-10/IL-12p40的特征和调控机制,为进一步研究PCV2的致病机理奠定基础。