目的：柯萨奇病毒B组(Coxsackievirus group B，CVB)属于小RNA病毒科肠道病毒属，是非常严重的人类疾病的致病病原，它的感染可以造成严重的心肌炎、心包炎，根据流行病学调查显示，50％左右的心肌炎与近期或复发的柯萨奇病毒B组3型(CVB3)感染有关。近年来，DNA疫苗的研究发展在CVB3感染的防治方面起到了至关重要的作用。VP1是CVB3的主要衣壳蛋白，具有较强的免疫原性，可诱导机体产生保护性中和抗体。我实验室曾利用DNA疫苗的靶向策略，构建融合DNA疫苗pcDNA3/MDC-VP1，免疫小鼠后显著提高了中和抗体滴度，对致死量病毒攻击的保护作用有一定的提高，但仍达不到满意的效果。因此，寻找合适的基因佐剂，提高CVB3DNA疫苗的免疫效果成为目前的研究焦点。　　 巨噬细胞源趋化因子(macrophage-derived chemokine，MDC)属于CC趋化因子家族，具有趋化单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、T细胞等功能，其带有信号肽序列，可分泌到细胞外与Th2细胞、APCs等细胞膜上表达的受体（CCR4等）结合发挥趋化作用。MDC主要增强Th2细胞相关的免疫反应，是因为MDC对Th2细胞(Th2细胞选择性高表达CCR4)具有强烈的趋化作用。　　 IFN-Υ是体内重要的免疫调节因子，可增强NK细胞、单核巨噬细胞对病毒的杀伤和吞噬作用，抑制病毒的复制。IFN-Υ促进Th0细胞向Th1型分化，增强机体的细胞免疫。增加抗原递呈细胞的MHc-Ⅱ分子表达，能够产生CTL应答和提高IgG抗体。　　 本研究选用IFN-Υ基因，与MDC构建融合基因表达质粒pcDNA3/MDC-IFN-γ，作为基因佐剂，和pcDNA3/MDC-VP1共免疫，检测免疫效果，探讨其用作基因佐剂，有无提高CVB3 VP1 DNA疫苗的免疫效应。以寻找最有效辅佐DNA疫苗的基因佐剂。　　 方法：　　 1.重组质粒pMD18-T/IFN-Υ的构建根据IFN-Υ基因序列及MDC序列，设计带有BamHI和XhoI酶切位点的特异性引物，用PCR方法从质粒pcDNA3/IFN-中扩增IFN-Υ基因，将扩增产物与pMD18-T vector连接，转化入E.coli5a感受态菌，经转化、筛选和酶切鉴定，构建重组质粒pMD18-T/IFN-Υ。　　 2.真核表达质粒pcDNA3/MDC-IFN-Υ的构建取经BamHI和XhoI双酶切的Linker-IFN-Υ与经过同样两种酶切的pcDNA3/MDC-Linker片段连接，经过转化、筛选和酶切鉴定后，构建真核表达重组质粒pcDNA3/MDC-IFN-γ。　　 3.用碱裂解法从转化的E.coli5a中大量提取质粒pcDNA3/MDC-IFN-γ，用聚乙二醇(PEG)沉淀法进行纯化。　　 4.动物实验：将6～8周龄雄性BALB/c小鼠随机分为5组，每组20只。5组分别为生理盐水对照组、pcDNA3/ IFN-Υ对照组、pcDNA3/VP1对照组、pcDNA3/MDC-VP1对照组，pcDNA3/MDC-IFN-Υ＋pcDNA3/MDC-VP1组。纯化后的质粒以生理盐水稀释后，股四头肌注射免疫小鼠，每次每只接种100μg，每3周接种1次，共免疫3次；每次免疫接种后第14天，内眦静脉取血，分离血清，用微量中和试验（固定病毒-稀释血清法）检测血清中CVB3特异性中和抗体。　　 5.末次免疫后3周，用5LD50的CVB3腹腔内攻击，观察并记录小鼠死亡情况至感染后第21天。　　 结果：　　 1.成功构建原核重组质粒pMD18-T/IFN-Υ，限制酶切分析证明符合预期设计。　　 2.成功构建真核表达重组质粒pcDNA3/MDC-IFN-Υ，酶切鉴定可见特异性条带。　　 3.大量抽提质粒 pcDNA3/IFN-Υ、 pcDNA3/MDC-IFN-Υ、pcDNA3/MDC-VP1、pcDNA3/VP1，纯化后再次酶切鉴定，除可见预期的特异性条带外，未见其他非特异性条带。　　 4.接种小鼠后，各组血清中和抗体的平均效价分别为：pcDNA3/MDC-VP1组1:7.32,1:16.82,1：27.32；pcDNA3/MDC-IFN-Υ＋pcDNA3/MDC-VP1组1:7.58,1:18.66,1:30.31；生理盐水对照组、pcDNA3/IFN-Υ组、pcDNA3/VP1组各次平均效价均低于1:5。可见第二次免疫后pcDNA3/MDC-VP1组和pcDNA3/MDC-IFN-＋pcDNA3/MDC-VP1组小鼠的中和抗体效价开始显著升高；对这两组第一、二、三次免疫后中和抗体效价单因素方差分析后发现，两组第二、三次免疫接种后的抗体效价和第一次相比均有显著性差异，表明抗体的效价随注射次数的增加而提高。但两组间比较差异无统计学意义。　　 5.用5LD50攻击小鼠，各组21天生存率分别为：①组（生理盐水对照组）10％，②组（pcDNA3/IFN-组）20％,③组(pcDNA3/VP1组)15％,④组（pcDNA3/MDC-VP1组）40％,⑤组（pcDNA3/MDC-IFN-Υ＋pcDNA3/MDC-VP1组）35％。经过x2检验分析，尚不能确定后两组之间有统计学差异。　　 结论：　　 1.成功构建重组质粒pMD18-T/IFN-Υ。　　 2.成功构建真核表达重组质粒pcDNA3/MDC-IFN-Υ。　　 3.小鼠免疫后血中中和抗体滴度随免疫次数的增加而提高，在pcDNA3/MDC-IFN-Υ＋pcDNA3/MDC-VP1联合免疫组和pcDNA3/MDC-VP1单独免疫组中比较，免疫无统计学意义。说明此次构建疫苗佐剂对体液免疫水平虽有一定程度的提高，但效果不显著。　　 4.对小鼠受到病毒感染后的生存状况进行分析，发现pcDNA3/MDC-IFN-Υ作为疫苗佐剂，仍不能有效地保护小鼠对抗致死量病毒感染。