【摘 要】
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背景癌钙调蛋白(omcomodulin, OM)是二十世纪七十年代末Macmanus从大鼠肝癌组织中提取出的一种小分子蛋白,有研究表明OM有促进神经生长的作用,并且有加大神经生长因子促进视
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背景癌钙调蛋白(omcomodulin, OM)是二十世纪七十年代末Macmanus从大鼠肝癌组织中提取出的一种小分子蛋白,有研究表明OM有促进神经生长的作用,并且有加大神经生长因子促进视神经生长的作用。目的体外拼装癌钙调蛋白(OM)/鱼精蛋白截短体(tp)融合基因,将其克隆至原核表达载体pET22b,并在大肠杆菌BL21中诱导表达癌钙调蛋白/鱼精蛋白截短体融合蛋白。方法从大鼠腹腔巨噬细胞中提取细胞的总RNA,设计引物扩增癌钙调蛋白基因,并在其3’端引入鱼精蛋白截短体(tp)的编码基因,经PCR扩增获得OM/tp融合基因,将目的基因克隆至中间载体PUC57中,提取质粒PUC57-OM/tp,并测序鉴定。将克隆后的基因亚克隆至原核表达载体pET22b中,提取质粒PET22b-OM/tp,测序鉴定。质粒构建成功后,在大肠杆菌BL21中化学诱导表达,表达产物经过SDS-PAGE及Western-blot验证。结果琼脂糖凝胶电泳获得目的基因(OM/tp),大小与预期的目的基因大小一致,目的基因克隆后,菌检PCR获得长度在500bp左右的阳性克隆,与预期大小一致。抽提质粒酶切后与载体PET22b连接转化大肠杆菌感受态细胞DH5a,菌检PCR获得长度在500bp左右OM/tp的阳性克隆,与预期大小一致。抽提质粒PET22b-OM/tp,经测序后与预期的序列一致。不同浓度的IPTG诱导表达后,细菌裂解上清中均出现大小约为18.4kDa的新生蛋白带,与预期的大小相符,光度扫描分析显示目的蛋白表达量占上清蛋白的43.4%。两种诱导浓度对蛋白表达量影响不明显,经过Western—blot分析证实,该条带为带有6-His标签的OM/tp融合蛋白,提示OM/tp融合蛋白表达成功,且以可溶性表达为主。结论成功获得OM/tp融合基因,并在大肠杆菌中成功诱导表达OM/tp融合蛋白,为该融合蛋白促进视神经损伤后再生的研究奠定了基础
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