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研究背景真菌性角膜炎是由致病真菌侵袭角膜引起的致盲率极高的感染性角膜病变,主要危害我国青壮年劳动力。在我国真菌性角膜炎的发病与植物性外伤密切相关,且致病菌种主要为镰刀菌和曲霉菌等丝状真菌。研究表明,中性粒细胞是早期参与角膜抗真菌感染的主要免疫细胞。除了经典的吞噬、脱颗粒以及呼吸爆发等机制,中性粒尚可通过中性粒细胞胞外捕获这一胞外杀菌机制杀灭病原微生物。体外研究表明,曲霉菌和白色念珠菌均可诱导中性粒细胞形成NETs。目前对NETs抗真菌感染的体内研究主要集中在肺部曲霉感染,皮肤及口腔真菌感染,而对于我国常见的角膜腐皮镰孢菌感染中是否存在NETs杀菌机制以及NETs在真菌性角膜炎中的作用尚未见报道。因此,揭示NETs在小鼠角膜腐皮镰孢菌感染早期中的作用,将为真菌性角膜炎药物治疗提供理论基础或潜在的药物靶点。研究目的探讨中性粒细胞胞外捕获在小鼠真菌性角膜炎早期病程中的作用。选取SPF级雄性C57BL/6J小鼠28只,小鼠周龄8-12周。裂隙灯下检查双眼角膜均无病变。实验分为模型组和手术对照组。根据监测时间点又将小鼠随机分为0h、12h、24h、36h亚组,0h组为正常角膜,每亚组8只眼(n=8)。模型组小鼠用无菌刀片在角膜中央直径为1mm的环形区域内进行十字划痕并接种腐皮镰孢菌;手术对照组仅在角膜中央进行十字划痕,不接种真菌。应用体视显微镜分别在上述各时间点对小鼠角膜进行观察拍照并在裂隙灯下对角膜病变程度进行临床评分。然后分别在0h、12h、24h、36h处死小鼠,每组取2个角膜进行透射电镜观察,取6个小鼠角膜进行角膜整铺片NETs免疫荧光染色,分别用H1组蛋白抗体、中性粒弹性蛋白酶抗体、钙荧光白(Calcofluor White,CFW)和DAPI标记组蛋白、中性粒细胞弹性蛋白酶、真菌菌丝和细胞核。应用双光子激光扫描显微镜观察角膜整铺片并对角膜缘、周边角膜、旁中央及中央角膜进行Z序列扫描。测定每个角膜NETs含量和真菌体积,采用SPSS16.0统计软件对结果进行统计分析。材料与方法结果正常小鼠角膜上皮完整,角膜透明。术后12h,手术对照组和模型组角膜创伤均未愈合,角膜中央轻度混浊。术后24h,手术对照组角膜中央上皮已基本愈合,而模型组角膜浸润灶呈灰白色牙膏样,表面有菌丝苔被,呈现典型的真菌性角膜炎临床表现。术后36h,手术对照组角膜创伤完全愈合;模型组角膜病变加重,角膜全层均匀致密混浊,有大量前房积脓。随时间点延长,手术对照组角膜病变临床评分总体比较差异有统计学意义(c2=17.743,P=0.000<0.05)。手术对照组术后12h和24h临床评分与0h比较,差异均有统计学意义(P=0.001<0.05);术后36h临床评分与0h相比呈升高趋势,但差异无统计学意义(P=0.138>0.05);术后24h与12h比较,差异亦无统计学意义(P=1.000>0.05);术后12h和24h临床评分与36h比较差异均有统计学意义(P=0.019<0.05)。模型组随时间点延长角膜病变临床评分逐渐增加,总体比较差异有统计学意义(c2=21.129,P=0.000<0.05)。术后各时间点角膜病变临床评分与0h比较差异均有统计学意义(P=0.001,0.002<0.05)。术后24h、36h角膜病变临床评分与12h相比,差异有统计学意义(P=0.002,0.003<0.05),而24h与36h角膜病变临床评分无显著性差异(P=0.057>0.05)。同一时间点各组角膜病变临床评分比较,术后12h,模型组和手术对照组差异无统计学意义(P=0.317>0.05);术后24h和36h,模型组和手术对照组比较有显著性差异(P=0.002,0.003<0.05)。正常角膜未检测到NETs结构。术后各时间点,手术对照组角膜中央可见少量中性粒细胞浸润,但未见典型NETs结构。角膜感染真菌后12h,模型组角膜中央可见少量NETs结构;感染后24h,NETs免疫荧光染色和透射电镜均显示模型组角膜中央有大量典型的NETs结构包绕并真菌,真菌细胞壁被破坏,细胞器溶解。角膜旁中央和周边区域也可见NETs结构,主要分布在角膜基质层。感染后36h,角膜中央和旁中央均可见NETs结构与菌丝相互作用,菌丝明显被破坏,中性粒细胞围绕菌丝形成环形浸润带限制菌丝向周边扩散。模型组角膜NETs含量自12h逐渐增多,在感染24h最多,感染36h开始减少,总体比较差异有统计学意义(c2=12.331,P=0.002<0.05)。角膜感染真菌后12h可检测到NETs形成。在感染后24h,NETs含量进一步增加,与感染后12h比较,差异有统计学意义(P=0.004<0.05)。感染36h与24h比较,NETs含量呈下降趋势,差异有统计学意义(P=0.006<0.05)。而感染后36h与12h相比,NETs评分无显著性差异(P=0.077>0.05)。自感染后12h至36h,角膜菌丝量逐渐增多,真菌体积定量总体差异有统计学意义(F时间=28.598,P=0.000<0.05)。感染后24h与感染后12h相比,真菌含量增加,差异有统计学意义(P=0.025<0.05)。感染后36h,与感染后12h和24h相比较,差异均具有统计学意义(P=0.001,0.020<0.05)。真菌体积定量与NETs含量无明显相关性(r=0.054,P=0.832>0.05)。模型组角膜病变临床评分与NETs含量呈明显正相关(r=0.514,P=0.029<0.05)。模型组角膜病变临床评分与真菌含量也呈明显正相关(r=0.828,P=0.000<0.05)。结论1.小鼠角膜腐皮镰孢菌感染早期存在NETs杀菌机制,NETs含量在感染24h最多。2.NETs和真菌均影响感染早期角膜病变程度。