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肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)一种是常见且致死率极高的恶性肿瘤，高居全球恶性肿瘤死亡率的第三位，严重威胁人类健康和生命。肝癌侵袭力强，经手术切除、肝移植后患者五年生存率仅为70%，加上肝癌的预后较差，复发风险较高，因此HCC的早期诊断意义重大。甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)肝癌标记物被广泛应用于临床医学诊断，但受肝癌细胞分化程度等因素的影响，单独AFP诊断肝癌的敏感性仅60%～70%，临床诊断价值极有限。诸多研究表明在不同临床分期HCC患者血清中的可溶性程序性死亡因子配体1(Soluble programmed death factor ligand 1，sPD-L1)表达水平有显著差异且具有统计学意义，与AFP的表达水平呈显著正相关。肝癌治疗领域专家表示，肿瘤标志物sPD-L1或许可成为HCC临床诊断的辅助性血清标志物，AFP联合sPD-L1检测对提高肝癌诊断检测的敏感性具有重要的意义。目前，肝癌血清标志物诊断的方法主要有免疫胶体金技术(GICA)、酶联免疫吸附技术(ELISA)、化学发光免疫分析法(CLIA)、放射性免疫分析法(RIA)等。其中，ELISA法的重复性差，需要多次抗体孵育和反复清洗等步骤；GICA法检测灵敏度较低、定量难；CLIA法需专业检测设备，成本较高且不利于现场检测；RIA检测结果易受待测样品的处理方式、降解酶、盐及PH等的影响。探求一种快速、准确、低成本的免疫检测方法对肝癌诊断具有重要意义。肝癌血清标志物的检测主要以抗原抗体发生免疫结合反应为基础，目前国内生产的肝癌血清标志诊断物产品质量不一，国外进口价格昂贵。制备高效价、特异性强、成本较低的肝癌血清标志物抗原抗体可为肝癌的早期快速检测提供有效试剂。
基于交流动电效应和阻抗免疫传感的微粒操控技术具有灵敏度高、特异性好，无需标记、成本较低，操作简单和便携等优势。国外的相关文献报道该技术可成功检测到fM水平的BPA和Zika病毒RNA的定量检测。前期本实验室利用该微粒操控技术成功检测了新城疫病毒(NDV)、猪圆环病毒(PCV)、禽流感病毒(AIV)、布鲁氏菌(Brucellosis)抗体等，但用于肝癌血清标志物的检测尚未见报道。该技术以制得的AFP、sPD-L1抗原抗体为检测试剂，通过对微电极芯片的清洗方式及AFP和sPD-L1抗体的最佳包被条件、封闭时间以及最佳交流电检测条件进行优化，初步建立基于交流动电效应和阻抗免疫传感的肝癌血清标志物快速检测方法。后期可通过保护剂对包被抗体的芯片进行处理后真空密封保存，使用时，仅需连接一台手机大小的微型阻抗仪，即可完成现场1min快速检测。
本文的研究内容如下：
(1)甲胎蛋白(AFP)在原核系统中高效表达及纯化
根据GenBank中提供的AFP全基因序列(GenBank登录号：NM_001134.2)，进行大肠杆菌的密码子偏好性分析及优化，化学方法合成AFP全基因。将AFP全基因连接至pET28a(+)质粒载体并转入大肠杆菌感受态细胞，成功构建pET28a(+)-AFP/BL21(DE3)。分别从诱导时间、温度、IPTG浓度筛选出AFP重组蛋白的最佳诱导条件。获得大量表达的AFP重组蛋白后，利用His-tag镍柱纯化AFP重组蛋白，纯化后的AFP重组蛋白经SDS-PAGE电泳纯度鉴定、BCA法浓度测定、Western-blot特异性鉴定。
(2)AFP单克隆抗体的制备及其生物学鉴定
以上述制得的AFP重组蛋白为免疫原，腹腔注射免疫BALB/c小鼠。经4次免疫后，取免疫小鼠眼眶血进行细胞融合前血清效价的测定。并于细胞融合前三天，双倍剂量抗原加强免疫小鼠。利用PEG1500诱导小鼠的脾细胞悬液与骨髓瘤细胞融合，通过有限稀释法、间接ELISA法对融合后的细胞上清进行筛选，以筛得稳定分泌抗体的杂交瘤阳性细胞株。对阳性细胞株进行两次以上的亚克隆以保证筛得AFP单克隆杂交瘤细胞株并扩大培养，将单克隆杂交瘤细胞腹腔注射到小鼠体内诱生AFP腹水单抗，后经proteinA柱纯化。对提纯的AFP抗体进行生物特性鉴定：包括SDS-PAGE纯度鉴定，BCA法浓度测定，单抗亚型鉴定、Western-blot特异性鉴定，酶联免疫吸附试验(ELISA)对单抗效价测定等。
(3)建立并优化微粒操控技术并应用于AFP、sPD-L1抗原的特异性检测
微电极芯片的预处理：芯片扫频、镜检观察电阻丝是否有短路或断路，对芯片清洗方式的优化及芯片的臭氧活化，以有利于亲水性的活性基团与AFP、sPD-L1抗体的相结合。对AFP、sPD-L1抗体的包被浓度及包被时间、最佳封闭时间进行优化，然后将芯片连接阻抗仪检测AFP、sPD-L1抗原。优化阻抗仪检测电参数(交流电压及电流电频率)，初步建立微粒操控技术并应用于AFP、sPD-L1抗原的特异性检测。从灵敏度、特异性和重复性等对微粒操控技术进行评价。
结果：
(1)双酶切鉴定结果表明该AFP重组质粒成功构建。重组质粒转化到BL21感受态细胞后，在30℃，0.1mmoL/LIPTG浓度，诱导8h的条件下，AFP重组蛋白可大量表达，经Ni柱亲和层析纯化，SDS-PAGE结果表明纯化后的AFP重组蛋白纯度较高，BCA法测得浓度达0.9239mg/mL。Westernblot结果表明纯化后的AFP重组蛋白与市售的AFP抗体能发生强烈的特异性结合。
(2)经统计，第一次细胞融合的融合率为78.6%，阳性率达73.2%，三次亚克隆共筛得3株AFP单克隆杂交瘤细胞株，分别命名1-10D、2-8D、6-3C。第二次细胞融合的融合率达100%，阳性率达99.7%，四次亚克隆筛选共得4株能稳定分泌AFP单抗的单克隆杂交瘤细胞株，分别命名3-6C、4-5C、3-9F、6-10F。上述细胞株经冻存复苏和多次传代，仍能分泌高效价抗体。亚型鉴定结果表明第一次细胞融合的1-10D、2-8D、6-3C均为IgG2a型。诱生的AFP腹水单抗，经proteinA柱纯化及SDS-PAGE电泳鉴定。结果发现在55KD、25KD处分别出现条带且无杂带，这与IgG型抗体的重链及轻链大小相符合，纯化效果较好。BCA法测得抗体浓度可达到2.0180mg/mL，Westernblot结果表明，纯化的腹水单抗同AFP重组蛋白能发生特异性结合，ELISA结果显示，AFP单抗同市售的AFP抗原及自制的AFP重组蛋白均能发生强烈的反应，效价均可达到1:2048000。
(3)芯片的最佳清洗方式：异丙醇超声清洗10min→无水乙醇超声清洗10min→超纯水超声清洗10min。抗体的最佳修饰条件：10μg/mL的AFP单抗在37℃包被1h，1%superblock25℃封闭30min；10μg/mL的sPD-L1单抗在37℃包被3h，1%superblock25℃封闭30min。阻抗仪最佳检测电参数均为100mV交流电压和100kHZ交流电频率。在最佳交流电参数下分别检测0.1、1.0、10、100、1000ng/mL的AFP、sPD-L1抗原稀释液。结果表明该微粒操控技术对AFP、sPD-L1抗原的检测下限均可达1ng/mL，检测结果较稳定。特异性实验中，芯片分别包被AFP、sPD-L1单抗以检测正常人及肝癌血清样品，结果表明该微粒操控技术检测AFP、sPD-L1抗原的特异性(特异性检出阴性率)均可达96.7%。重复性实验中共检测20例肝癌血清和4例正常人血清(每例样品做三组平行)，AFP单抗负载芯片的灵敏度(特异性检出阳性率)达95%，sPD-L1单抗负载芯片的灵敏度可达96.6%。临床实验相关性结果表明肝癌血清中AFP与sPD-L1的表达呈一定正相关。
结论：
本研究成功构建pET28a(+)-AFP/BL21(DE3)基因工程菌，经大量诱导表达及纯化，制得纯度较高的AFP重组蛋白。以此为免疫原，经长程免疫法，PEG1500促细胞融合、有限稀释法和ELISA筛选，两次细胞融合共筛得到7株能稳定分泌AFP单克隆抗体的细胞株。诱生的腹水单抗经ProteinA柱纯化制得效价高且特异性的AFP抗体。利用制备的AFP抗原和抗体及前期实验室制得并保存sPD-L1抗原抗体，建立了微粒操技术的AFP、sPD-L1抗原快速检测方法，从灵敏度、特异性、重复性及临床样品的检测等对该技术进行评价。结果表明，利用该技术检测肝癌血清标志物，具有较高的灵敏度和特异性，重复性良好。本研究为肝癌早期的现场快速诊断提供了有效试剂和低成本的检测新技术。
基于交流动电效应和阻抗免疫传感的微粒操控技术具有灵敏度高、特异性好，无需标记、成本较低，操作简单和便携等优势。国外的相关文献报道该技术可成功检测到fM水平的BPA和Zika病毒RNA的定量检测。前期本实验室利用该微粒操控技术成功检测了新城疫病毒(NDV)、猪圆环病毒(PCV)、禽流感病毒(AIV)、布鲁氏菌(Brucellosis)抗体等，但用于肝癌血清标志物的检测尚未见报道。该技术以制得的AFP、sPD-L1抗原抗体为检测试剂，通过对微电极芯片的清洗方式及AFP和sPD-L1抗体的最佳包被条件、封闭时间以及最佳交流电检测条件进行优化，初步建立基于交流动电效应和阻抗免疫传感的肝癌血清标志物快速检测方法。后期可通过保护剂对包被抗体的芯片进行处理后真空密封保存，使用时，仅需连接一台手机大小的微型阻抗仪，即可完成现场1min快速检测。
本文的研究内容如下：
(1)甲胎蛋白(AFP)在原核系统中高效表达及纯化
根据GenBank中提供的AFP全基因序列(GenBank登录号：NM_001134.2)，进行大肠杆菌的密码子偏好性分析及优化，化学方法合成AFP全基因。将AFP全基因连接至pET28a(+)质粒载体并转入大肠杆菌感受态细胞，成功构建pET28a(+)-AFP/BL21(DE3)。分别从诱导时间、温度、IPTG浓度筛选出AFP重组蛋白的最佳诱导条件。获得大量表达的AFP重组蛋白后，利用His-tag镍柱纯化AFP重组蛋白，纯化后的AFP重组蛋白经SDS-PAGE电泳纯度鉴定、BCA法浓度测定、Western-blot特异性鉴定。
(2)AFP单克隆抗体的制备及其生物学鉴定
以上述制得的AFP重组蛋白为免疫原，腹腔注射免疫BALB/c小鼠。经4次免疫后，取免疫小鼠眼眶血进行细胞融合前血清效价的测定。并于细胞融合前三天，双倍剂量抗原加强免疫小鼠。利用PEG1500诱导小鼠的脾细胞悬液与骨髓瘤细胞融合，通过有限稀释法、间接ELISA法对融合后的细胞上清进行筛选，以筛得稳定分泌抗体的杂交瘤阳性细胞株。对阳性细胞株进行两次以上的亚克隆以保证筛得AFP单克隆杂交瘤细胞株并扩大培养，将单克隆杂交瘤细胞腹腔注射到小鼠体内诱生AFP腹水单抗，后经proteinA柱纯化。对提纯的AFP抗体进行生物特性鉴定：包括SDS-PAGE纯度鉴定，BCA法浓度测定，单抗亚型鉴定、Western-blot特异性鉴定，酶联免疫吸附试验(ELISA)对单抗效价测定等。
(3)建立并优化微粒操控技术并应用于AFP、sPD-L1抗原的特异性检测
微电极芯片的预处理：芯片扫频、镜检观察电阻丝是否有短路或断路，对芯片清洗方式的优化及芯片的臭氧活化，以有利于亲水性的活性基团与AFP、sPD-L1抗体的相结合。对AFP、sPD-L1抗体的包被浓度及包被时间、最佳封闭时间进行优化，然后将芯片连接阻抗仪检测AFP、sPD-L1抗原。优化阻抗仪检测电参数(交流电压及电流电频率)，初步建立微粒操控技术并应用于AFP、sPD-L1抗原的特异性检测。从灵敏度、特异性和重复性等对微粒操控技术进行评价。
结果：
(1)双酶切鉴定结果表明该AFP重组质粒成功构建。重组质粒转化到BL21感受态细胞后，在30℃，0.1mmoL/LIPTG浓度，诱导8h的条件下，AFP重组蛋白可大量表达，经Ni柱亲和层析纯化，SDS-PAGE结果表明纯化后的AFP重组蛋白纯度较高，BCA法测得浓度达0.9239mg/mL。Westernblot结果表明纯化后的AFP重组蛋白与市售的AFP抗体能发生强烈的特异性结合。
(2)经统计，第一次细胞融合的融合率为78.6%，阳性率达73.2%，三次亚克隆共筛得3株AFP单克隆杂交瘤细胞株，分别命名1-10D、2-8D、6-3C。第二次细胞融合的融合率达100%，阳性率达99.7%，四次亚克隆筛选共得4株能稳定分泌AFP单抗的单克隆杂交瘤细胞株，分别命名3-6C、4-5C、3-9F、6-10F。上述细胞株经冻存复苏和多次传代，仍能分泌高效价抗体。亚型鉴定结果表明第一次细胞融合的1-10D、2-8D、6-3C均为IgG2a型。诱生的AFP腹水单抗，经proteinA柱纯化及SDS-PAGE电泳鉴定。结果发现在55KD、25KD处分别出现条带且无杂带，这与IgG型抗体的重链及轻链大小相符合，纯化效果较好。BCA法测得抗体浓度可达到2.0180mg/mL，Westernblot结果表明，纯化的腹水单抗同AFP重组蛋白能发生特异性结合，ELISA结果显示，AFP单抗同市售的AFP抗原及自制的AFP重组蛋白均能发生强烈的反应，效价均可达到1:2048000。
(3)芯片的最佳清洗方式：异丙醇超声清洗10min→无水乙醇超声清洗10min→超纯水超声清洗10min。抗体的最佳修饰条件：10μg/mL的AFP单抗在37℃包被1h，1%superblock25℃封闭30min；10μg/mL的sPD-L1单抗在37℃包被3h，1%superblock25℃封闭30min。阻抗仪最佳检测电参数均为100mV交流电压和100kHZ交流电频率。在最佳交流电参数下分别检测0.1、1.0、10、100、1000ng/mL的AFP、sPD-L1抗原稀释液。结果表明该微粒操控技术对AFP、sPD-L1抗原的检测下限均可达1ng/mL，检测结果较稳定。特异性实验中，芯片分别包被AFP、sPD-L1单抗以检测正常人及肝癌血清样品，结果表明该微粒操控技术检测AFP、sPD-L1抗原的特异性(特异性检出阴性率)均可达96.7%。重复性实验中共检测20例肝癌血清和4例正常人血清(每例样品做三组平行)，AFP单抗负载芯片的灵敏度(特异性检出阳性率)达95%，sPD-L1单抗负载芯片的灵敏度可达96.6%。临床实验相关性结果表明肝癌血清中AFP与sPD-L1的表达呈一定正相关。
结论：
本研究成功构建pET28a(+)-AFP/BL21(DE3)基因工程菌，经大量诱导表达及纯化，制得纯度较高的AFP重组蛋白。以此为免疫原，经长程免疫法，PEG1500促细胞融合、有限稀释法和ELISA筛选，两次细胞融合共筛得到7株能稳定分泌AFP单克隆抗体的细胞株。诱生的腹水单抗经ProteinA柱纯化制得效价高且特异性的AFP抗体。利用制备的AFP抗原和抗体及前期实验室制得并保存sPD-L1抗原抗体，建立了微粒操技术的AFP、sPD-L1抗原快速检测方法，从灵敏度、特异性、重复性及临床样品的检测等对该技术进行评价。结果表明，利用该技术检测肝癌血清标志物，具有较高的灵敏度和特异性，重复性良好。本研究为肝癌早期的现场快速诊断提供了有效试剂和低成本的检测新技术。