论文部分内容阅读
补阳还五汤在临床上对缺血性脑中风先兆期、急性期、恢复期及后遗症期均有较好的综合疗效，由黄芪、当归、川芎、赤芍、桃仁、红花、地龙七味药材组成，本方具有益气、行血活血之功效。本研究旨在筛选补阳还五汤与红细胞膜的作用靶点成分，运用可针对中药成分复杂特点进行高通量筛选的生物膜固相色谱法对靶点成分进行筛选，并进行相应的药理活性验证，夯实补阳还五汤“行血活血”药效水平的理论基础，更好地指导制剂制备。
目的:
利用高通量红细胞膜固相色谱法筛选补阳还五汤与红细胞膜的作用靶点成分，鉴定并探究各效应成分所对应的药材归属，并进行相应的红细胞膜生物学指标活性验证，夯实补阳还五汤“行血活血”药效水平的理论基础，以探讨其“行血活血”药效物质基础。
方法:
1.采用红细胞膜固相色谱法，分别就不同SPE填料及洗脱方法筛选了补阳还五汤样品前处理方法，并通过补阳还五汤与红细胞膜悬液的结合与解离，建立红细胞膜固相色谱法。
2.通过采用红细胞膜固相色谱法与高分辨液质联用仪联用的方法，对补阳还五汤与红细胞膜特异结合的效应成分进行定性分析，结合文献数据库及标准品对照，对部分效应成分进行结构鉴定;在获取分子信息后，将其与单味药材提取液分子信息比对，初步确定其药材归属。
3.补阳还五汤效应成分对红细胞膜上Na+-K+-ATP酶、唾液酸、巯基、超氧化物歧化酶、丙二醛和胆固醇等影响红细胞膜状态的基本指标的含量变化进行研究，从而初步探索补阳还五汤与红细胞膜结合成分在“行血活血”方面的作用。
结果:
1.通过针对固相萃取小柱的填料及洗脱方法进行优选，最终确定使用C18-N型SPE小柱对样品进行富集处理。其洗脱步骤为:色谱甲醇、去离子水活化平衡SPE小柱，上样后去离子水清洗，室温静置30s，30％乙腈水溶液进行洗脱后氮气吹干定容即可。通过对C18-N型SPE小柱回收率的考察发现，有13个吸收峰相较于过柱前的回收率超过30％，可适用于后续红细胞膜固相色谱法中对解离液的富集。针对未结合成分洗涤次数和供试品溶液加入量进行优选，最终确定将5mL补阳还五汤供试品溶液加至5mL红细胞膜悬液中进行结合，洗涤非特异性结合的成分次数确定为4次。
2.经与数据库比对，解离液中初步可识别13种化合物，其中正离子模式下扫描显示得13种成分信息，分子式分别为C16H12O5、C23H28O11、C27H30O17、C22H22O10、C48H78O18、C17H16O5、C24H24O11、C23H26O10、C23H28O10、C47H78O19、C25H28O11、C43H70O15及C45H72O16。经过标准品图谱比对，最终确定补阳还五汤与红细胞膜结合的成分包括化合物毛蕊异黄酮、芍药内酯苷、6-羟基山柰酚-3，6-二-O-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮苷及大豆皂苷Bb。
3.经过将补阳还五汤中各单味药材提取液与效应成分解离液质谱所得碎片信息分析比对可得，解离液中C16H12O5、C24H24O11、C23H28O10、C23H26O10等化合物来源于黄芪药材;C23H26O10、C23H28O11等化合物来源于赤芍药材;化合物C16H12O5来源于川芎药材;化合物C27H30O17来源于红花药材;化合物C22H22O10来源于桃仁药材;另外当归和地龙药材供试液中并未发现与解离液对应的成分。其中化合物C23H26O10和C23H28O10同时包含于黄芪和赤芍药材中，化合物C16H12O5包含于黄芪和川芎药材中。
4.补阳还五汤效应成分对红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性影响:在浓度范围0.1～10μg·mL-1之间，6-羟基山柰酚-3，6-二-O-葡萄糖苷和毛蕊异黄酮苷对红细胞膜上Na+-K+-ATP酶的活力影响基本持平略有下降;毛蕊异黄酮和芍药内酯苷均对红细胞膜上Na+-K+-ATP酶的活力具有双重调控作用;大豆皂苷Bb在0.1～10μg·mL-1浓度范围内均表现出对红细胞膜上Na+-K+-ATP酶的活力具有显著提高作用。
补阳还五汤效应成分对红细胞膜唾液酸含量影响:在浓度范围0.1～10μg·mL-1之间，毛蕊异黄酮、芍药内酯苷、6-羟基山柰酚-3，6-二-O-葡萄糖苷和毛蕊异黄酮苷均能不同程度提高红细胞膜唾液酸的含量;芍药内酯苷0.1和1.0μg·mL-1浓度组与10.0μg·mL-1浓度组比较具有显著作用;大豆皂苷Bb随着药物浓度的增加，反而表现出呈不断下降的反比趋势。
补阳还五汤效应成分对红细胞膜巯基含量影响:在浓度范围0.1～10μg·mL-1之间，毛蕊异黄酮、芍药内酯苷、6-羟基山柰酚-3，6-二-O-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮苷和大豆皂苷Bb均能显著提高红细胞膜总巯基的含量。
补阳还五汤效应成分对红细胞膜超氧化物歧化酶含量影响:在浓度范围0.1～10μg·mL-1之间，毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷均能显著提高红细胞膜T-SOD活力;芍药内酯苷仅在1.0μg·mL-1浓度下表现对红细胞膜T-SOD活力的显著提高;6-羟基山柰酚-3，6-二-O-葡萄糖苷在0.5～10.0μg·mL-1浓度范围内表现对红细胞膜T-SOD活力的显著提高;大豆皂苷Bb随着给药浓度的增加，其对红细胞膜T-SOD活力的提高随之增加。
补阳还五汤效应成分对红细胞膜丙二醛含量影响:毛蕊异黄酮在0.1、0.5及10.0μg·mL-1浓度下对大鼠红细胞膜MDA含量的影响结果无差异;6-羟基山柰酚-3，6-二-O-葡萄糖苷在0.1～1.0μg·mL-1浓度范围内对大鼠红细胞膜MDA含量的影响未获得结果;毛蕊异黄酮苷在0.1～10.0μg·mL-1浓度范围内均表现出对大鼠红细胞膜MDA含量的下降作用，结果与对照组比较无显著性差异;芍药内酯苷和大豆皂苷Bb各组实验未获结果。
补阳还五汤效应成分对红细胞膜总胆固醇含量影响:在浓度范围0.1～10μg·mL-1之间，毛蕊异黄酮、6-羟基山柰酚-3，6-二-O-葡萄糖苷和大豆皂苷Bb均表现为降低红细胞膜T-CHO含量，且毛蕊异黄酮和大豆皂苷Bb均表现出显著下降作用;芍药内酯苷和毛蕊异黄酮苷在各浓度下检测所得结果与对照组比较无显著性差异。
结论:
通过采用红细胞膜固相色谱法与高分辨液质联用仪联用的方法，对补阳还五汤与红细胞膜特异结合的效应成分进行定性分析，研究发现共有13种化合物与红细胞膜结合，其中毛蕊异黄酮、芍药内酯苷、6-羟基山柰酚-3，6-二-O-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮苷及大豆皂苷Bb经过标准品对照鉴定，并探究其对红细胞膜生物学指标的影响，结果提示补阳还五汤与红细胞膜结合成分在“行血活血”方面除大豆皂苷Bb外，其余5种化合物均在不同程度发挥作用，揭示补阳还五汤“行血活血”功效的作用物质基础可能为毛蕊异黄酮、芍药内酯苷、6-羟基山柰酚-3，6-二-O-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮苷等。
目的:
利用高通量红细胞膜固相色谱法筛选补阳还五汤与红细胞膜的作用靶点成分，鉴定并探究各效应成分所对应的药材归属，并进行相应的红细胞膜生物学指标活性验证，夯实补阳还五汤“行血活血”药效水平的理论基础，以探讨其“行血活血”药效物质基础。
方法:
1.采用红细胞膜固相色谱法，分别就不同SPE填料及洗脱方法筛选了补阳还五汤样品前处理方法，并通过补阳还五汤与红细胞膜悬液的结合与解离，建立红细胞膜固相色谱法。
2.通过采用红细胞膜固相色谱法与高分辨液质联用仪联用的方法，对补阳还五汤与红细胞膜特异结合的效应成分进行定性分析，结合文献数据库及标准品对照，对部分效应成分进行结构鉴定;在获取分子信息后，将其与单味药材提取液分子信息比对，初步确定其药材归属。
3.补阳还五汤效应成分对红细胞膜上Na+-K+-ATP酶、唾液酸、巯基、超氧化物歧化酶、丙二醛和胆固醇等影响红细胞膜状态的基本指标的含量变化进行研究，从而初步探索补阳还五汤与红细胞膜结合成分在“行血活血”方面的作用。
结果:
1.通过针对固相萃取小柱的填料及洗脱方法进行优选，最终确定使用C18-N型SPE小柱对样品进行富集处理。其洗脱步骤为:色谱甲醇、去离子水活化平衡SPE小柱，上样后去离子水清洗，室温静置30s，30％乙腈水溶液进行洗脱后氮气吹干定容即可。通过对C18-N型SPE小柱回收率的考察发现，有13个吸收峰相较于过柱前的回收率超过30％，可适用于后续红细胞膜固相色谱法中对解离液的富集。针对未结合成分洗涤次数和供试品溶液加入量进行优选，最终确定将5mL补阳还五汤供试品溶液加至5mL红细胞膜悬液中进行结合，洗涤非特异性结合的成分次数确定为4次。
2.经与数据库比对，解离液中初步可识别13种化合物，其中正离子模式下扫描显示得13种成分信息，分子式分别为C16H12O5、C23H28O11、C27H30O17、C22H22O10、C48H78O18、C17H16O5、C24H24O11、C23H26O10、C23H28O10、C47H78O19、C25H28O11、C43H70O15及C45H72O16。经过标准品图谱比对，最终确定补阳还五汤与红细胞膜结合的成分包括化合物毛蕊异黄酮、芍药内酯苷、6-羟基山柰酚-3，6-二-O-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮苷及大豆皂苷Bb。
3.经过将补阳还五汤中各单味药材提取液与效应成分解离液质谱所得碎片信息分析比对可得，解离液中C16H12O5、C24H24O11、C23H28O10、C23H26O10等化合物来源于黄芪药材;C23H26O10、C23H28O11等化合物来源于赤芍药材;化合物C16H12O5来源于川芎药材;化合物C27H30O17来源于红花药材;化合物C22H22O10来源于桃仁药材;另外当归和地龙药材供试液中并未发现与解离液对应的成分。其中化合物C23H26O10和C23H28O10同时包含于黄芪和赤芍药材中，化合物C16H12O5包含于黄芪和川芎药材中。
4.补阳还五汤效应成分对红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性影响:在浓度范围0.1～10μg·mL-1之间，6-羟基山柰酚-3，6-二-O-葡萄糖苷和毛蕊异黄酮苷对红细胞膜上Na+-K+-ATP酶的活力影响基本持平略有下降;毛蕊异黄酮和芍药内酯苷均对红细胞膜上Na+-K+-ATP酶的活力具有双重调控作用;大豆皂苷Bb在0.1～10μg·mL-1浓度范围内均表现出对红细胞膜上Na+-K+-ATP酶的活力具有显著提高作用。
补阳还五汤效应成分对红细胞膜唾液酸含量影响:在浓度范围0.1～10μg·mL-1之间，毛蕊异黄酮、芍药内酯苷、6-羟基山柰酚-3，6-二-O-葡萄糖苷和毛蕊异黄酮苷均能不同程度提高红细胞膜唾液酸的含量;芍药内酯苷0.1和1.0μg·mL-1浓度组与10.0μg·mL-1浓度组比较具有显著作用;大豆皂苷Bb随着药物浓度的增加，反而表现出呈不断下降的反比趋势。
补阳还五汤效应成分对红细胞膜巯基含量影响:在浓度范围0.1～10μg·mL-1之间，毛蕊异黄酮、芍药内酯苷、6-羟基山柰酚-3，6-二-O-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮苷和大豆皂苷Bb均能显著提高红细胞膜总巯基的含量。
补阳还五汤效应成分对红细胞膜超氧化物歧化酶含量影响:在浓度范围0.1～10μg·mL-1之间，毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷均能显著提高红细胞膜T-SOD活力;芍药内酯苷仅在1.0μg·mL-1浓度下表现对红细胞膜T-SOD活力的显著提高;6-羟基山柰酚-3，6-二-O-葡萄糖苷在0.5～10.0μg·mL-1浓度范围内表现对红细胞膜T-SOD活力的显著提高;大豆皂苷Bb随着给药浓度的增加，其对红细胞膜T-SOD活力的提高随之增加。
补阳还五汤效应成分对红细胞膜丙二醛含量影响:毛蕊异黄酮在0.1、0.5及10.0μg·mL-1浓度下对大鼠红细胞膜MDA含量的影响结果无差异;6-羟基山柰酚-3，6-二-O-葡萄糖苷在0.1～1.0μg·mL-1浓度范围内对大鼠红细胞膜MDA含量的影响未获得结果;毛蕊异黄酮苷在0.1～10.0μg·mL-1浓度范围内均表现出对大鼠红细胞膜MDA含量的下降作用，结果与对照组比较无显著性差异;芍药内酯苷和大豆皂苷Bb各组实验未获结果。
补阳还五汤效应成分对红细胞膜总胆固醇含量影响:在浓度范围0.1～10μg·mL-1之间，毛蕊异黄酮、6-羟基山柰酚-3，6-二-O-葡萄糖苷和大豆皂苷Bb均表现为降低红细胞膜T-CHO含量，且毛蕊异黄酮和大豆皂苷Bb均表现出显著下降作用;芍药内酯苷和毛蕊异黄酮苷在各浓度下检测所得结果与对照组比较无显著性差异。
结论:
通过采用红细胞膜固相色谱法与高分辨液质联用仪联用的方法，对补阳还五汤与红细胞膜特异结合的效应成分进行定性分析，研究发现共有13种化合物与红细胞膜结合，其中毛蕊异黄酮、芍药内酯苷、6-羟基山柰酚-3，6-二-O-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮苷及大豆皂苷Bb经过标准品对照鉴定，并探究其对红细胞膜生物学指标的影响，结果提示补阳还五汤与红细胞膜结合成分在“行血活血”方面除大豆皂苷Bb外，其余5种化合物均在不同程度发挥作用，揭示补阳还五汤“行血活血”功效的作用物质基础可能为毛蕊异黄酮、芍药内酯苷、6-羟基山柰酚-3，6-二-O-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮苷等。