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苹果等蔷薇科果树属于S-RNase介导配子体自交不亲和类型,由花柱S-RNase进入花粉管发挥细胞毒性作用阻止自我花粉管生长引起的生殖隔离现象。目前研究认为花柱自我和非自我S-RNase均能进入花粉管内,非自我S-RNase被花粉SLF/SFB识别并泛素化降解,而自我S-RNase则能降解花粉管内RNA,导致蛋白质合成受阻,花粉管发生细胞程序性死亡,但作为26-30kD的大分子分泌型糖蛋白S-RNase如何跨膜进入花粉管内仍是一个谜。本研究以苹果‘国光’(S1S2)为试材,利用花柱S1-RNase为诱饵筛选花粉酵母cDNA文库,获得一个ABC跨膜转运蛋白,通过结构分析、生化性质研究、转运功能研究及转基因验证,揭开了苹果ABC转运蛋白在细胞骨架协同作用下运送S-RNase至花粉管囊泡导致自交不亲和反应的谜团,主要研究结果如下：1、以苹果‘国光’花柱S1-RNase成熟多肽区为诱饵筛选其花粉酵母cDNA文库获得6个互作子,NCBI分析表明其中1个为ABC转运家族蛋白,酵母共转化结果表明其与S1-、S2-、S5-、S7-和S9-RNase均互作,不具备S单元型特异结合；组织特异性分析表明其在花粉中表达量最高；保守结构域分析表明其具有ABC家族典型的NBD区；跨膜预测分析表明ABC蛋白具有多个跨膜多肽区；MEAG5聚类分析表明ABC蛋白与拟南芥、杨树ABCF类蛋白相似,命名为MdABCF。2、MdABCF-CFP载体基因枪转入‘国光’花粉、MdABCF-GFP载体基因枪转入洋葱表皮及PEG转化玉米原生质体瞬时表达结果显示MdABCF在细胞质膜上表达；MdABCF和S-RNase的苹果叶片BiFC实验表明两者在细胞膜上相互作用；酵母共转化、pull-down及BiFC分段互作分析发现MdABCF跨膜区Tran、NBD2(658-679aa)与S1-RNase结合。3、添加S1-RNase培养反义寡核苷酸转染沉默MdABCF表达的‘国光’花粉,其长度(36.75μm)显著高于未沉默MdABCF对照(3.5μm)；添加FITC标记的S1-RNase培养花粉,花粉管内可见荧光点,但沉默的花粉管内未见；S1-RNase抗体免疫荧光分析发现,沉默MdABCF的花粉管内S-RNase主要集中在膜外；添加FITC和RBITC两种不同染料分别标记S1、S2-RNase培养苹果自交后代S2S2、S9S9纯合体花粉,沉默MdABCF的花粉管内同样未见荧光点。上述结果证明MdABCF能够非选择性的运送S-RNase至花粉管内,且自我和非自我S-RNase与MdABCF之间不存在竞争性结合运输。4、S2-RNase和‘国光’花柱蛋白粗提物添加培养S2S2花粉,花粉生长(10μm和5μm)受到显著抑制；鬼笔环肽标记微丝、P-tublin标记微管及Western检测S2-RNase培养的S2S2花粉,发现花粉管微丝、微管解聚,花粉管内S-RNase呈先上升后下降趋势；S1-RNase分别与LatA、 Oryzalin和Taxol混合培养‘国光’花粉,花粉生长(34.88μm、44.13μm和52.13μm)显著高于仅添加S1-RNase的对照,其细胞骨架解聚程度与单独使用药品相当；FITC-S1-RNase分别与LatA、Oryzalin和Taxol共培养‘国光’花粉,花粉管内少见荧光点；FITC-S2-RNase培养经基因枪分别转化高尔基体和内质网maker的S2S2花粉,发现S2-RNase与高尔基体共定位在囊泡上；酵母RNA降解法分析S-RNase活性,发现药剂处理后,S-RNase活性并未改变；Taxol处理‘国光’花粉后自交授粉实验发现,处理的花粉生长长度远高于自交的对照花粉管,说明改变微管结构能够阻碍S-RNase运输进而影响花粉管的生长。5、利用pFGC5941载体分别构建35S和Lat52启动子的过表达MdABCF、PhABCF以及沉默PhABCF的转基因载体,通过农杆菌介导叶盘法转基因将其转入自交不亲和矮牵牛中,发现沉默PhABCF能够改变植株自交不亲和性,自交后代T1结实率分析显示,PhABCF下调的转基因植株后代仍然能够保持自交结实的性状。该结果表明MdABCF是输送S-RNase关键因子,通过抑制MdABCF表达阻碍S-RNase的运输最终能够影响植株的自交亲和性。根据以上研究,我们认为苹果花柱S-RNase与花粉MdABCF转运蛋白的跨膜Tran区结合,由ATP提供能量,以内吞的方式进入膜内,在微丝、微管骨架的辅助作用下通过高尔基体囊泡系统运输至花粉管液泡中,积累到一定量后,被释放进入花粉管胞质,调控微丝微管骨架解聚,花粉管生长停滞,最终引起自交不亲和反应。