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山葡萄是葡萄属中最抗寒的一个种,对多种欧亚种群易感的病害都有较强的抵抗力。它是目前国内外葡萄抗寒和抗病育种的主要种质资源。而野生山葡萄一般为雌雄异株,两性花类型极为罕见。本研究利用AFLP分子标记技术,研究与山葡萄性别相关的分子标记,同时将其转化为简单实用的scAR标记,以实现葡萄性别的早期鉴定,加快葡萄育种进程。由于葡萄的性别是由性别基因决定,因此研究葡萄雌雄植株之间表达差异的基因,为进一步研究山葡萄的性别决定和分化机制提供理论依据,为克隆其性别相关基因奠定基础。本研究取得了以下主要结果:
通过构建山葡萄雌花、雄花和完全花基因池方法与AFLP技术相结合,利用64对引物对三个基因池进行扩增,筛选到五对具有多态性的引物,利用这五对引物对组池个体进行扩增,结果发现只有引物E-AGC/M-CTG与山葡萄性别相关,利用该引物对其它已知性别的14份山葡萄种质资源进行验证,发现该引物在供试的雄花和完全花中能产生特异性条带,而雌花中没有该特异性条带出现,初步证明该AFLP标记与山葡萄性别相关。
根据AFLP标记片段序列设计特异性引物,在已知性别的85份山葡萄种质中进行扩增,发现在所有的雄花和完全花中都能扩增出人小为220bp的特异性条带,而供试的55份雌花中,53份没有出现该特异性条带,准确率为97.6%,证明该AFLP标记成功转换为SCAR标记,并且可以用于以山葡萄作为亲本的杂交后代性别的早期鉴定。
建立了山葡萄cDNA-AFLP体系,利用该体系研究山葡萄雌雄花问差异表达的基因,共筛选了64对引物,获得46个在不同花型中表达差异的基因片段,这些差异片段大部分是表现有或无的差异,只有少部分是表现表达量的差异。同时利用cDNA-AFLP分析了山葡萄雌花和雄花不同发育时期基因表达的差异,获得15个在不同时期表达的差异片段。