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慢性肾脏病（Chronic Kidney Disease，CKD）的发病率及患病率呈逐年递增的趋势，已成为威胁公共健康的世界性难题。调查显示，西方国家大约有8-10％人口受其影响，而我国CKD患者人数已超过1亿，并且呈现出年轻化发病趋势。肾纤维化是慢性肾脏病终末期的共同途径和病理基础，其病变严重程度和肾功能恢复密切相关。因此，深入剖析肾纤维化的发病机制，探索肾间质纤维化的防治方法已成为肾脏病的研究热点之一。 成纤维细胞特异性蛋白-1（Fibroblast-specific protein1,FSP-1），也被称为S100A4，是S100的钙结合蛋白家族的一员，它从小鼠乳腺癌细胞中分离出来，亦可在骨髓、胸腺、脾脏和淋巴细胞的 mRNA中检测到。FSP-1表达于肾脏、肺以及心脏等具有组织重塑能力器官的肌成纤维细胞，在正常机体微量表达或不表达，当上皮细胞在病理状态下往肌成纤维细胞或肿瘤细胞转变时FSP-1表达增强。故FSP-1已被普通认为是肌成纤维细胞的特异性标记蛋白，并普遍用于鉴定组织纤维化过程中上皮细胞经历上皮间质转化（Epithelial Mesenchymal Transition，EMT）的标志。然而，近年来，越来越多论证开始质疑 FSP-1作为成纤维细胞标记蛋白的特异性，而在大鼠肾间质炎症和小鼠肾小球肾炎模型中发现，大部分FSP-1+细胞表达单核细胞的标记蛋白，这使得FSP-1用于检测肾脏炎症反应中肌成纤维细胞或体内上皮间质转化的实用性开始被质疑，此外，关于FSP-1+细胞在肾纤维化中的调节机制的研究也是少有开展。 Notch信号通路是生物进化守恒的通路，是细胞发展、分化、存活及发挥功能的关键调节器，在生物基本发育进程的细胞-细胞交流中起着至关重要的作用。本研究先是通过建立单侧输尿管梗阻（Unilateral ureteral obstruction，UUO）小鼠模型，运用免疫组化、免疫荧光双染技术、免疫印迹（Western blot）、RT-PCR技术，观察FSP-1+细胞在单侧输尿管梗阻肾组织中的表达情况；再通过免疫荧光技术发现人体梗阻性肾脏病肾切除术后肾脏组织标本中出现FSP-1+和CD45+细胞浸润的现象，初步得出和动物实验相一致的发现；最后应用GFP-STOPLoxP/LoxP/FSP-1-cre小鼠，将 FSP-1-GFP转基因小鼠与野生型（Wild Type，WT）小鼠完成骨髓移植实验，论证梗阻性肾脏中的FSP-1+细胞主要是骨髓源性的造血细胞，并且观察到单侧输尿管梗阻小鼠模型中Notch通道显著激活，探讨了FSP-1+细胞上Notch通道的活化对肾间质炎症与纤维化的影响。 目的: 1．探讨单侧输尿管梗阻后小鼠肾组织中FSP-1+细胞的分类与来源。 2．探讨Notch信号通路在FSP-1+细胞内的表达及与单侧输尿管梗阻小鼠肾间质炎症和纤维化的关系。 方法: 1.（1）雄性野生型 C57BL/6小鼠60只适应性喂养1周后，采用随机分组的方法分为两组：假手术组（Sham）和模型组(UUO)，分别于造模成功后的第3天和第7天处死小鼠，其中每批每组小鼠各5只。PAS（ Periodic caid-Schiff,PAS）染色观察各组小鼠肾脏病理形态，免疫组化法检测FSP-1蛋白表达情况；采用小鼠静脉注射有丝分裂标记物---BrdU的方法，结合免疫荧光技术检测肾间质FSP-1+细胞增殖情况；Western blot检测肾组织FSP-1、血小板源性生长因子受体-α（Platelet-derived growth factor receptor-α,PDGFR-α）、纤维连接蛋白（Fibronectin,FN）、增殖细胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen,PCNA）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）蛋白的表达情况；免疫荧光双染技术检测单侧输尿管梗阻小鼠模型肾组织中FSP-1+分别与α-SMA+、PDGFR-α+、 CD45+以及F4/80+细胞双染的情况。 （2）应用免疫荧光技术观察人体梗阻性肾脏病肾切除术后肾脏组织标本FSP-1和CD45表达情况。 2.（1）将FSP-1启动子携带GFP表达的FSP-1-GFP报道基因小鼠应用于单侧输尿管梗阻小鼠模型，GFP荧光染色将特异性地标记FSP-1-GFP报道基因小鼠肾组织内 FSP-1+细胞。应用免疫荧光双染技术检测 GFP+与α-SMA+或PDGFR-α+共表达情况；流式细胞技术观察FSP-1+细胞特性。 （2）将 FSP-1-GFP供体小鼠和野生型（WT）小鼠进行骨髓移植实验：将FSP-1-GFP供体小鼠的骨髓细胞移植给WT小鼠，同时将WT小鼠的骨髓细胞移植给FSP-1-GFP小鼠，之后建立单侧输尿管梗阻肾纤维化模型。应用免疫荧光技术观察骨髓移植后各组小鼠FSP-1+和GFP+细胞浸润情况。 （3）RT-PCR技术观察单侧输尿管梗阻小鼠肾组织中两个Notch配体（Jag1和Dll4）、四个Notch受体（Notch1-4）、Hes/Hey家族（Hes1,Hey1和Hey2）三个典型 Notch靶基因以及 Notch信号转录抑制剂的时序性转录水平情况；Western blot法检测NICD（Notch intracellular domain,NICD）和Jagged1蛋白的表达；免疫荧光双染技术检测FSP-1+与NICD+细胞共表达情况。 结果: 一、单侧输尿管梗阻小鼠肾组织中FSP-1+细胞的分类和来源 1.免疫组织化学法动态观察单侧输尿管梗阻后小鼠肾小管-间质中 FSP-1+细胞随时间增长而数量增多，各时间点差异比较有统计学意义（P<0.05）。BrdU染色结果显示 BrdU+细胞主要表达在肾间质区域，单侧输尿管梗阻后第7天BrdU+细胞数比第3天增多，FSP-1+与BrdU+双染细胞数亦明显增多，差异比较有统计学意义（P<0.05）。与假手术组相比，Western blot法检测显示梗阻肾组FSP-1、PDGFR-α、FN、PCNA、α-SMA蛋白的表达上调。以上实验结果提示梗阻肾小鼠肾组织中出现FSP-1+细胞浸润及增殖的现象，且FSP-1+细胞是梗阻肾后肾间质增殖的主要细胞类型。 2．免疫荧光细胞标记技术发现梗阻肾小鼠肾脏组织显示FSP-1和PDGFR-α或α-SMA双染阳性的细胞非常少，FSP-1+/α-SMA+仅占每高倍视野总细胞数的2.27%， FSP-1+/PDGFR-α+仅占高倍视野总细胞数的1.27%，但可见大约60%FSP-1+细胞表达 CD45+造血细胞，同时，出现很大比例巨噬细胞标记物F4/80+与FSP-1+共染阳性的细胞（95.9±0.66%）。提示FSP-1+细胞可表达造血细胞的标记蛋白，FSP-1+并非成纤维细胞的特异性标记蛋白。 3.人体梗阻性肾脏病肾切除术后肾脏组织中，免疫荧光检测发现肾间质区域FSP-1+、CD45+细胞数量较正常增多，可见FSP-1+/CD45+双染细胞。提示人体梗阻性肾脏组织中浸润的FSP-1+细胞可能来源于造血细胞，初步得出和动物实验相一致的发现。 二、Notch信号通路在 FSP-1+细胞内的表达及与单侧输尿管梗阻小鼠肾间质炎症和纤维化的关系 1.利用 FSP-1-GFP报道基因小鼠建立单侧输尿管梗阻模型，免疫荧光双染发现在间质中GFP+/α-SMA+或GFP+/PDGFR-α+共表达阳性的细胞仅占一小部分（GFP+/α-SMA+：3.89%，GFP+/PDGFRα+：5.4%）；分离假手术组及梗阻肾组小鼠肾组织细胞，采用流式细胞技术分析、分选细胞，结果显示单侧输尿管梗阻后第7天肾组织中 FSP-1+细胞的数量显著增加，且大部分为造血细胞（约60%FSP-1+细胞为CD45+细胞，FSP-1+/F4/80+巨噬细胞和FSP-1+/CD3+淋巴细胞数量也显著增加）；而 FSP-1+/α-SMA+共表达的肌成纤维细胞仅仅占2.5%。以上结果提示 FSP-1+并非成纤维细胞的特异性标记蛋白，FSP-1+细胞主要为骨髓源性的造血细胞。 2.骨髓移植实验结果显示将WT小鼠骨髓移植到FSP-1-GFP小鼠，单侧输尿管梗阻后小鼠肾组织中绝大多数间质浸润的细胞为 FSP-1+/GFP-，个别为FSP-1+/GFP+双染阳性细胞；反之，将FSP-1-GFP供体小鼠骨髓移植到WT小鼠，梗阻肾组织中>95% FSP-1+细胞是GFP+细胞。 3. RT-PCR检测显示与正常对照组相比，单侧输尿管梗阻小鼠肾组织中四个Notch受体蛋白（Notch1-4）、两个配体（Jag1和Dll4）的mRNA转录水平均明显上调，差异比较具有统计学意义（P<0.05）。Western blot检测显示梗阻肾小鼠肾组织中Jagged1和NICD表达上调。以上结果显示单侧输尿管梗阻小鼠肾组织中Notch通道激活，单侧输尿管梗阻造模损伤后Notch信号在FSP-1+细胞被活化。免疫荧光检测发现单侧输尿管梗阻后小鼠第7天肾组织FSP-1与NICD双染阳性的细胞数明显增多。 结论：单侧输尿管梗阻小鼠模型中间质浸润的FSP-1+细胞主要来源于骨髓-单核巨噬细胞系；梗阻肾组织内FSP-1+单核/巨噬细胞中Notch信号被活化，参与梗阻性肾脏病的炎症和间质纤维化过程中。