第一部分 激光捕获纤维切割与微量RNA的提取、纯化、浓缩 目的:摸索一条可行的技术路线,运用激光捕获显微切割(LCM)技术获取无间质混杂的人正常子宫内膜腺管上皮细胞与子宫内膜癌细胞,用于进行子宫内膜癌相关基因差异表达的研究。 方法:采用LCM技术分别从正常子宫内膜组织及子宫内膜癌组织冰冻切片中捕获子宫内膜腺管上皮细胞及子宫内膜癌细胞,提取微量RNA,并对微量RNA进行纯化及浓缩。设立对照实验鉴定微量RNA的完整性,分光光度计检测RNA的浓度。 结果:分别从冰冻切片中捕获子宫内膜腺管上皮细胞280,000 shootings,捕获子宫内膜癌细胞196,000 shootings。对照实验Ⅰ、Ⅱ证实经LCM后RNA完整性较好。确定了LCM shooting次数与可获得RNA量间对应关系。 结论:通过LCM技术可以从冰冻切片中捕获单一类型的目的细胞,此过程不会造成细胞RNA明显降解,可以应用于下游的实验研究。 第二部分 人子宫内膜癌相关基因cDNA片段的筛选、克隆与鉴定 目的:筛选、克隆与鉴定人子宫内膜癌发病相关基因片段,探索子宫内膜癌发生的分子机制。 方法:采用荧光差异显示技术(FDD-PCR)比较LCM捕获细胞提取的正常子宫内膜腺管细胞RNA与子宫内膜癌细胞RNA,筛选与子宫内膜癌发病特异相关的差异基因片段,克隆测序后反向Northern点杂交(使用扩增的RNA)验证差异片段的真假,对阳性片段利用genebank进行BLAST比对分析。