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在卵巢癌的治疗中,顺铂类化疗药物仍是其一线药物,并取得了一些治疗效果。随着顺铂在卵巢癌治疗中的广泛应用,发现卵巢癌细胞逐渐对其产生耐受,这也是临床卵巢癌治疗的难点。顺铂主要是作用于细胞内的DNA,导致DNA损伤,进而导致细胞周期停滞和凋亡。文献报道,内质网应激、自噬等细胞适应性反应可能参与了卵巢癌等肿瘤的顺铂耐受。自噬能隔离细胞质中的成分,并与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解细胞内损伤的细胞器及堆积的蛋白质,为细胞代谢提供物质。在正常的生理或者药物刺激条件下,自噬保护肿瘤细胞免于化疗药物诱导的细胞凋亡。也有研究表明,过度或者持续的自噬导致肿瘤细胞死亡。自噬在肿瘤细胞中可能发挥双重作用,但其准确的作用机制仍然存在争议。自噬是溶酶体依赖的过程,并且在自噬末端需要与溶酶体融合形成自噬溶酶体,保障自噬通量顺利进行,同时自噬体与溶酶体的融合需要消耗大量溶酶体。随着研究的深入,发现自噬可能参与了肿瘤细胞化疗药物如顺铂的耐受。而溶酶体功能与数量的维持对自噬通量是至关重要的,因此我们推测自噬-溶酶体可能与肿瘤细胞的化疗药物耐受有关。研究发现在溶酶体内含有丰富的ATP,由于溶酶体也是细胞的降解中心,其腔内较低的p H环境和水解酶对溶酶体的降解功能至关重要,而ATP可为溶酶体内酸性环境和其内水解酶活性提供所需的能量。具有较低p H的溶酶体腔是溶酶体内水解酶活化的最佳环境,V-ATP酶对溶酶体酸性环境的维持具有重要作用,而V-ATP酶蛋白质复合物功能的维持需要ATP提供能量。溶酶体内部分水解酶的高表达也与肿瘤有关,尤其是恶性肿瘤中常高表达Cathepsin D;若其缺陷可诱导细胞死亡;而Cathepsin D在溶酶体内发挥活性需要ATP为其提供能量。溶酶体功能受损时,降低自噬溶酶体的功能,甚至影响自噬溶酶体融合,严重时溶酶体内的水解酶可被释放至细胞质中,触发细胞凋亡。我们推测减少溶酶体内ATP可能会导致溶酶体功能受损,降低自噬溶酶体功能,影响自噬通量,因而溶酶体内ATP可能是调控肿瘤细胞化疗药物耐受的重要决定因素。本研究以人卵巢癌细胞SKOV3细胞(亲代)和SKOV3/DDP细胞(顺铂耐受)为研究对象,基于ATP调控溶酶体探讨自噬通量在卵巢癌顺铂耐药的作用及机制,为肿瘤化疗药物耐受的治疗提供新的策略。方法:⑵MTT法检测顺铂对人卵巢癌SKOV3和SKOV3/DDP细胞存活率的影响。⑵顺铂处理人卵巢癌SKOV3和SKOV3/DDP细胞后,通过Western blot检测Cleaved Caspase-3,p62,LC3,LAMP1,Cathepsin D表达;间接免疫荧光方法观察p62与LC3或Ub的共定位。⑶利用激光共聚焦显维镜观察SKOV3和SKOV3/DDP细胞中LTR着色的变化,和LAMP1与LC3共定位。⑷利用Cathepsin D活性试剂盒,检测SKOV3和SKOV3/DDP细胞中Cathepsin D活性的改变。⑸利用自噬抑制剂3-MA或CQ,抑制自噬后,MTT法检测SKOV3/DDP细胞存活率的变化;通过Western blot检测p62,LC3,Ub,Bcl-2,Bax,Cleaved Caspase-3,Cathepsin D和t Bid的表达;激光共聚焦显维镜观察LAMP1与LC3共定位,LTR着色的变化;Cathepsin D活性试剂盒检测Cathepsin D活性的改变;流式细胞术测量细胞凋亡率。⑹Cathepsin D活性抑制剂Pep A抑制Cathepsin D活性后,Western blot检测p62,LC3和Ub的表达;Cathepsin D活性试剂盒检测Cathepsin D活性变化;间接免疫荧光的方法检测LAMP1与LC3共定位。⑺利用激光共聚焦显微镜,通过Quinacrine染色检测细胞中溶酶体内ATP;利用DIDS抑制溶酶体内ATP聚集,通过激光共聚焦显微镜观察LTR染色的变化;Western blot检测p62和LC3表达;间接免疫荧光的方法检测LAMP1与LC3共定位。结果1.与SKOV3细胞相比,SKOV3/DDP细胞对顺铂相对不敏感;顺铂可以诱导SKOV3和SKOV3/DDP细胞LC3-II表达增加;与SKOV3细胞相比,顺铂作用SKOV3/DDP细胞12h时,LC3-II蛋白表达较高,同时间接免疫荧光也观察到大量点聚集的p62和LC3共定位,提示顺铂可以诱导SKOV3和SKOV3/DDP细胞发生自噬,相比SKOV3细胞,SKOV3/DDP细胞中自噬水平较高。2.与SKOV3细胞相比,在SKOV3/DDP细胞中,无论有无顺铂处理,溶酶体膜标志蛋白LAMP1及溶酶体内Cathepsin D表达较高;且顺铂诱导SKOV3/DDP细胞溶酶体内LTR着色增强,Cathepsin D活性增高。3.与自噬抑制剂3-MA和顺铂联合应用相比,靶向溶酶体的自噬抑制剂CQ与顺铂的联合应用更加明显地减少SKOV3/DDP细胞的存活率,引起LC3-II,p62和泛素化蛋白表达增加,减弱细胞内LTR着色,降低Cathepsin D活性,甚至发生线粒体途径凋亡。4.在SKOV3/DDP细胞中,Cathepsin D活性抑制剂Pep A和顺铂的联合,明显地降低了Cathepsin D活性,减弱LTR着色,同时也上调了p62,LC3-II和泛素化蛋白的表达水平。5.相对SKOV3细胞,SKOV3/DDP细胞中含有更加丰富的ATP;DIDS抑制SKOV3/DDP细胞的溶酶体内ATP聚集后,明显地减少了细胞中溶酶体内ATP的含量,同时上调了p62和LC3-II蛋白的表达,增加了LAMP1和LC3的共定位,减弱了LTR着色,降低Cathepsin D活性。结论:1.顺铂能够诱导卵巢癌细胞发生自噬,相对于SKOV3细胞,SKOV3/DDP细胞中自噬水平较高;与SKOV3细胞相比,在SKOV3/DDP细胞中,无论有无顺铂处理,溶酶体膜标志蛋白LAMP1及溶酶体内Cathepsin D表达较高;顺铂诱导SKOV3/DDP细胞溶酶体内LTR着色增强和Cathepsin D活性升高,说明相对SKOV3细胞,SKOV3/DDP细胞内含有较丰富的溶酶体和Cathepsin D,这些结果提示自噬-溶酶体途径可能与卵巢癌细胞的顺铂耐受有关。2.靶向溶酶体的自噬抑制剂CQ与顺铂的联合应用比早期阶段自噬抑制剂3-MA和顺铂联合应用,更加明显地减少SKOV3/DDP细胞的存活率,增加p62,LC3-II和泛素化蛋白的表达,减弱LTR着色和降低Cathepsin D活性,引起自噬溶酶体的蓄积,甚至触发线粒体途径凋亡,说明通过干扰溶酶体功能而抑制自噬通量增加了SKOV3/DDP细胞对顺铂的敏感性,提示自噬保护卵巢癌细胞免于顺铂诱导的凋亡,而且溶酶体可能通过调控自噬通量参与卵巢癌的顺铂耐受。3.相对SKOV3细胞,SKOV3/DDP细胞中含有较丰富的Cathepsin D;抑制溶酶体内Cathepsin D的活性,可增加自噬相关蛋白p62,LC3-II的表达,降低溶酶体内LTR着色和Cathepsin D活性,提示溶酶体内Cathepsin D可能通过维护溶酶体的降解功能保障自噬通量,参与卵巢癌的顺铂耐受。4.对比SKOV3细胞,SKOV3/DDP细胞的溶酶体内含有较丰富的ATP,DIDS抑制SKOV3/DDP细胞的溶酶体内ATP聚集,明显地增加了自噬相关蛋白的表达,降低溶酶体内LTR着色和Cathepsin D活性,甚至引起自噬溶酶体蓄积,提示减少溶酶体内ATP不仅影响溶酶体,也可能干扰自噬溶酶体的降解功能,进而调控自噬通量参与卵巢癌细胞的顺铂耐受。本实验首次通过ATP调控溶酶体探讨自噬通量在卵巢癌顺铂耐药中的作用及机制,为克服肿瘤细胞化疗药物耐受提供新的策略。