毛竹干旱诱导Di19转录因子的鉴定及PeDi19-4基因的功能分析

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毛竹,一种最为常见的速生竹,在经济、生态和文化上,都有着重要的价值,其栽培面积最为广泛。其生长环境对气候和土壤的要求较高。然而全球气候环境不断地变化,恶劣的环境严重影响着植物的正常生长发育。Di19(Drought-induced)蛋白是一类干旱诱导蛋白,主要参与植物的非生物胁迫反应。目前,在很多物种中,已有功能的Di19蛋白被分离和鉴定出来。但是,在毛竹中,至今还没有Di19(Drought-induced)蛋白相关信息的报道。本文中,从毛竹的全基因组中共鉴定出了10个Di19(Drought-induced)蛋白。首先对这10蛋白的结构特点以及进化亲缘关系做了分析,并分析了这些蛋白在非生物胁迫下的表达水平。因此,鉴定出了一个候选基因—PeDi19-4。通过亚细胞定位、转录活性和DNA结合位点分析,发现PeDi19-4具有典型的转录因子特征。将PeDi19-4过表达,对获得转基因植物进行抗逆性鉴定。利用RNA-seq分析,得到DEGs,并对其功能分析。进一步地利用Ch IP-PCR实验,鉴定出PeDi19-4作用的靶基因。主要获得了如下结果:1.从公布的毛竹全基因组数据库中鉴定出10个Di19(Drought-induced)蛋白。通过氨基酸比对分析发现,这10个Di19蛋白在N端都包含两个非保守的Cys2/His2(Cys–X2-5–Cys–X12–His–X2-5–His)锌指结构域;在C端有一个保守的Di19_C结构域。通过综合进化树分析发现,这Di19蛋白被分为5个小亚组。且毛竹Di19蛋白和其他单子叶植物(水稻和小麦)的蛋白主要位于第3、4和5亚组。而1和2亚组是由双子叶植物(拟南芥、棉花和大豆)的蛋白组成。2.通过qRT-PCR,分析了这10个Di19基因在干旱、高盐以及ABA处理下的表达水平。结果显示在三种非生物胁迫下,这10个基因的表达量都有所升高,其中PeDi19-4的表达量最高。3.从毛竹的基因组中克隆出了PeDi19-4,其测序结果与毛竹基因组公布的序列一致。4.亚细胞定位分析发现,PeDi19-4是一个核蛋白;转录活性分析发现,PeDi19-4在酵母中不具有转录活性。EMSA实验结果发现,PeDi19-4可以和TACA(A/G)T顺式元件特异性结合。5.通过酵母双杂实验验证,钙离子依赖蛋白激酶(Pe CDPK22)能够和PeDi19-4蛋白互作,且Pe CDPK22蛋白响应的多种胁迫环境。6.PeDi19-4的转基因水稻(拟南芥)在正常情况下,和野生型植株比,在表型上没有明显差异。经过干旱和高盐处理后,过量表达植株在表型上表现出较强的抗逆性。同样在干旱和高盐处理下,过量表达植株和野生型植株比,含有较高的可溶性糖和脯氨酸。但是相对REL和MDA的含量却是低于WT的。7.PeDi19-4过量表达转基因水稻(拟南芥)和对照比在种子萌发和种苗生长初期都表现出较强的ABA敏感性。此外,在外源ABA处理下,过量表达植株叶片的气孔开张度也发生了明显变化。8.对获得转基因水稻进行转录组测序分析,干旱处理下得到736个上调和214个下调的差异表达基因,盐处理下得到598个上调和126个下调的差异表达基因。有214个差异表达基因的表达在两种处理下是上调的,有76个差异表达基因的表达在两种处理下是下调的。对这290个差异表达基因进行GO注释分析,发现有237个基因是响应外界环境胁迫且和ABA信号相关。从290个差异表达基因中,挑选12个已知功能的响应干旱和盐且依赖ABA信号通路的基因进行qRT-PCR分析,其表达趋势和转录组测序结果的表达趋势相一致。因此,PeDi19-4通过ABA信号通路提高植物的抗旱及抗盐能力。
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