目前中国已有超过9400万的糖尿病患者，这标志着中国已成糖尿病第一大国。临床观察表明,心血管疾病是糖尿病患者的“头号杀手”。糖尿病患者心肌梗死的发生率及死亡率都较非糖尿病患者高。尽管目前经皮冠状动脉成形术（PCI）以及他汀、ACEI等药物的广泛应用降低了急性心肌梗死患者的死亡率、挽救其心功能，但是仍缺乏具有直接心肌保护的可靠药物及方法。由于心肌细胞是终末分化细胞，因此避免心肌细胞的死亡对于保存心功能至关重要。心肌微血管内皮细胞是心肌与血液交换能量的主要屏障，也是心脏主要的内分泌器官。有研究表明，在缺血再灌注损伤过程中，心肌微血管内皮细胞的损伤可能是心肌细胞损伤的促发因素，在再灌注损伤过程中及早干预及治疗心肌微血管内皮细胞将最终避免心肌细胞进一步损伤。因此，心脏缺血再灌注损伤过程中对心肌细胞以及心肌微血管内皮细胞的保护都对整个心功能的保存至关重要。在糖尿病急性心肌梗死患者，即便是经过PCI开通大血管后，其微循环灌注差，“无复流”发生率高；长期随访发现心肌死亡增加、心功能恢复差。这表明糖尿病患者发生心肌梗死后心肌细胞、心肌微血管内皮细胞这两种心肌主要的功能细胞的死亡数量及由此产生的心功能损伤程度均远远高于非糖尿病患者。因此，明确糖尿病导致心血微血管及心肌细胞对缺血性损伤敏感性增加内在原因，对于降低糖尿病心源性死亡率具有重要意义。晚期糖基化终产物（advanced glycation end products, AGEs）是机体在长期高糖状态时蛋白质和还原糖之间经过非酶性糖基化反应生成的物质，它被认为是糖尿病最主要的致病物质之一。AGEs主要通过与其受体(RAGE)作用从而促发氧化应激反应，导致ROS大量产生,促进ICAM、VCAM、TNF-α、IL-6等一系列炎症因子的表达，导致细胞的损伤。最近有研究表明，与野生型小鼠相比，RAGE-/-小鼠心肌缺血再灌注损伤明显降低，同时伴有硝基酪氨酸（体内蛋白质被硝基化修饰的主要指标）水平增加。但是，AGEs/RAGE导致蛋白质被硝基化修饰的机制以及导致哪种蛋白质硝基化修饰仍不清楚，更重要的是AGEs/RAGE在心肌以及心肌微血管内皮细胞缺血性损伤中的作用及机制也未完全阐明。硫氧还蛋白（thioredoxin, Trx）是一种12kD大小的小分子蛋白。Trx是体内最主要的抗氧化物质之一，此外Trx在促进细胞增殖/生存和减少细胞凋亡方面也扮演关键的角色。最近有研究表明，Trx可选择性地透过细胞膜进入因缺血/再灌注而损伤的心肌细胞并发挥心肌保护作用，更为重要的是，Trx的Tyr49可以被氧化/硝化应激产物ONOO-硝基化修饰，导致其活性不可逆被抑制，并取消其抗凋亡作用。然而，Trx的这种硝基化修饰的上游调节分子以及在心肌微血管内皮细胞缺血性损伤中的作用仍不清楚。研究目的1、观察晚期糖基化终产物对心肌微血管内皮细胞及糖尿病心肌缺血再灌注损伤的影响。2、阐明晚期糖基化终产物对心肌微血管内皮细胞以及糖尿病心肌缺血再灌注损伤的影响是否与Trx硝基化有关。3、寻找治疗糖尿病心肌微血管内皮细胞及心肌缺血再灌注损伤的潜在治疗靶点。研究方法1.晚期糖基化终产物对心肌微血管内皮细胞缺氧/复氧损伤的影响及机制1.1采用非酶促反应体外制备糖基化修饰的牛血清白蛋白（AGE-BSA）。1.2采用酶消化法分离、培养、鉴定大鼠心肌微血管内皮细胞（CMECs）。1.3缺氧/复氧损伤模型的建立：无糖DMEM培养基置入含有1%O2/5%CO2/94%N2的模拟缺氧孵箱中4小时，然后换低糖DMEM培养基在常氧孵箱中复氧6小时。1.4第2代心肌微血管内皮细胞分别与AGE-BSA （100ug/ml）、AGE-BSA+EUK134(a peroxynitrite decomposition catalyst,7μM)、AGE-BSA+human Trx-1(hTrx-1)（100μg/ml）、AGE-BSA+sRAGE (4μg/ml, a RAGEdecoy)共孵育48小时后行缺氧/复氧损伤（缺氧4小时，复氧6小时）。1.5采用ELISA检测LDH及caspase-3含量评价缺血/复氧损伤1.6采用光泽精化学发光法检测超氧阳离子、ELISA测定硝基酪氨酸评价氧化/硝基化应激水平1.7采用western-blot检测Trx、iNOS、RAGE、gp91pox蛋白的表达1.8采用胰岛素二硫键还原法测定Trx活性以及免疫共沉淀检测Trx硝基化2.晚期糖基化终产物对糖尿病心肌缺血再灌注损伤中的影响及机制2.1糖尿病模型的制备：C57BL/6腹腔多次注射STZ (40mg/kg STZ)连续5天，血糖大于300mg/dl被认为是造模成功。2.2缺血/再灌注损伤模型的建立：用6-0丝线在小鼠冠脉左前降支打活结造成心肌缺血，缺血30min后将活结打开行再灌注。分别再灌注3h(除心肌梗死及心功能以外的检测指标)以及灌注24h（检测心梗面积及心功能）。假手术采用同样的方法，除了LAD不行结扎。2.3硝基化硫氧还蛋白的制备：h-Trx与SIN-1在37oC共孵育30min。2.4心肌点注射RAGE小干扰(RAGE siRNA)：打开小鼠胸腔，在需要点注射的心尖，心前区，左室后壁3点逐个部位进行点注射，每次注射量为20μl。2.5实验流程：糖尿病小鼠连续注射sRAGE(500μ/d，连续3天)或心肌点注射RAGE siRNA后2天行缺血再灌注损伤；糖尿病小鼠行缺血再灌注损伤，再灌注前10分钟分别给予腹腔注射Trx（2mg/kg），EUK-134(a peroxynitritedecomposition catalyst,5mg/kg)，硝基化硫氧还蛋白（N-hTrx）（2mg/kg），1400W(a selective iNOS inhibitor,2mg/kg)， apocynin(a selective NADPHoxidase inhibitor,5mg/kg)。2.6采用TTC及心脏超声检测心脏心梗面积及心功能。2.7采用TUNEL及α-actin双标的方法测定心肌细胞凋亡。2.8采用ELISA测定心肌组织羧甲基赖氨酸（CML）、硝基酪氨酸含量。2.9采用DHE染色及光泽精化学发光法检测心肌组织超氧阴离子的含量。2.10采用胰岛素二硫键还原法测定Trx活性以及免疫共沉淀检测硫氧还蛋白硝基化2.11采用western-blot检测Trx、iNOS、RAGE、gp91pox蛋白的表达研究结果1.晚期糖基化终产物对心肌微血管内皮细胞缺氧/复氧的影响及机制1.1AGEs增加心肌微血管内皮细胞的缺氧复氧损伤与对照组相比，100μ/ml的AGE-BSA增加CMECs的LDH、caspase-3含量（P<0.05），行缺氧/复氧损伤后LDH、caspase-3含量进一步增加（P<0.01）。1.2AGEs增加缺氧复氧诱导的心肌微血管内皮细胞的氧化硝化应激水平。与对照组相比，AGE-BSA增加CMECs的超氧阴离子产生、iNOS表达、总NO浓度以及硝基酪氨酸含量（all P<0.05），行缺氧/复氧损伤后上述指标进一步增加（all P<0.01）。1.3AGEs增加缺氧复氧诱导的心肌微血管内皮细胞的硝基化失活与对照组相比，AGE-BSA降低CMECs Trx活性（P<0.05），增加其硝基化水平（P<0.05），但不增加Trx的表达（p>0.05）1.4给予外源性的Trx或抑制Trx硝基化可以减轻CMECs缺氧/复氧损伤，减少RAGE的表达与Vehicle组相比，Trx及EUK134降低缺氧复氧诱导的CMECs的LDH含量（P<0.05）、caspase-3活性（P<0.05）以及减少RAGE的表达（p<0.05）。1.5给予sRAGE可以减轻CMECs缺氧/复氧损伤，减少缺氧/复氧诱导的硫氧还蛋白硝基化失活水平。与Vehicle组相比，sRAGE降低缺氧复氧诱导的CMECs的LDH含量（P<0.05）、caspase-3活性（P<0.05），降低iNOS以及NADPH氧化酶的表达（all P<0.05），降低Trx硝基化、恢复其活性（all P<0.05）2.晚期糖基化终产物对糖尿病小鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及机制2.1糖尿病小鼠心肌缺血再灌注损伤增加与非糖尿病小鼠相比，糖尿病小鼠行缺血再灌注损伤后其心梗面积增加、心功能降低(心梗面积:45.2+3.06vs.22.90+2.10%, P<0.01;心功能:60.60+5.38vs.41.10+5.15%P<0.01)。2.2糖尿病小鼠行缺血再灌注损伤后心肌Trx硝基化失活水平增加，而AGEs/RAGE表达增加。与非糖尿病小鼠相比，糖尿病小鼠行缺血再灌注损伤后RAGE表达加、CML浓度增加（all P<0.01），Trx硝基化水平增加，Trx活性降低（all P<0.001）。2.3sRAGE减少糖尿病小鼠心肌缺血再灌注损伤与Vehicle组相比，sRAGE降低糖尿病小鼠心梗面积，恢复期心功能（allP<0.05。2.4RAGE siRNA减少糖尿病小鼠心肌缺血再灌注损伤诱导的氧化/硝化应激以及Trx硝基化失活水平与Vehicle组相比，RAGE siRNA降低糖尿病小鼠缺血再灌注损伤诱导的iNOS及NADPH氧化酶表达（P<0.05），降低超氧阴离子生成（P<0.01）、硝基酪氨酸含量（P<0.05），降低Trx硝基化（P<0.05）、恢复硫氧还蛋白活性（P<0.01）。2.5iNOS抑制剂及NADPH氧化酶抑制剂降低Trx硝基化失活水平与Vehicle组相比，iNOS抑制剂及NADPH氧化酶抑制剂均减少糖尿病小鼠缺血再灌注损伤诱导的Trx硝基化（all P<0.05），恢复其活性（all P<0.05）。2.6抑制Trx硝基化或给予外源性Trx均减少缺血再灌注损伤诱导糖尿病小鼠的心肌细胞凋亡，然而硝基化的Trx却没有心肌保护作用与Vehicle组相比，Trx及EUK134均减少糖尿病小鼠缺血再灌注损伤诱导心肌细胞凋亡（all P<0.05）、降低caspase-3活性（all P<0.05），但是N-Trx对心肌细胞的凋亡及caspase-3活性没有影响（all P>0.05）.2.7抑制Trx或给予外源性Trx均减少缺血再灌注损伤诱导糖尿病小鼠的心肌细胞AGEs/RAGE的表达与Vehicle组相比，Trx及EUK134均减少糖尿病小鼠缺血再灌注损伤诱导心肌细CML含量（all P<0.05）、RAGE的表达（all P<0.05）；但是N-Trx对心肌细胞的CML含量、RAGE的表达均无影响（all P>0.05）.研究结论1、AGEs/RAGE是糖尿病小鼠心肌微血管内皮细胞及糖尿病心肌缺血再灌注损伤的重要原因。2、在糖尿病状态下，AGEs/RAGE表达增加，通过激活iNOS/NADPH oxidase导致Trx硝基化失活；另一方面Trx可以抑制AGEs/RAGE的表达，而硫氧还蛋白硝基化失活后对AGEs/RAGE表达的抑制作用被取消，导致更多的Trx被硝基化，从而形成“RAGE/硫氧还蛋白硝基化失活的恶性循环”。此恶性循环是糖尿病心肌微血管内皮细胞以及糖尿病心肌对缺血再灌注损伤敏感性增加的重要原因。2、通过阻断AGEs/RAGE信号或给予外源性的Trx可能是治疗糖尿病心肌微循环损伤或缺血性心肌病的潜在治疗方法。