目的:检测GSTA1基因多态性和GSTM1基因缺失多态性;测定GST的活性,并阐明GSTA1和GSTM1的基因多态性对GST活性的影响。考察家兔同时进行环磷酰胺和白消安静脉注射时,GST介导下的白消安药代动力学特征;以家兔和HepG2细胞为研究对象,考察环磷酰胺对家兔和HepG2细胞内GST活性的影响。方法:1.GSTA1和GSTM1基因多态性的检测使用柱式血液基因组提取试剂盒提取血液中的DNA,并通过PCR-RFLP技术手段对提取的DNA进行聚合酶链式反应,采用DNA测序仪对PCR扩增产物进行测序,从而确定GSTA1的基因分型,以及GSTM1的基因缺失情况。2.GST活性的测定使用紫外可见分光光度计,通过测量在GST特异性催化下,GSH与CDNB的反应结合产物在340nm处吸光度增加的速率,从而推算出GST的酶活性。3.GSTA1和GSTM1基因多态性对GST活性的影响将GSTA1和GSTM1基因多态性的检测结果和GST活性结果相联系,通过SPSS统计软件,运用LSD t-test检验的方法对二者的关系进行比较。4.同时给予BUCY静注后白消安的药动学研究健康的家兔5只,给药前禁食12h,家兔白消安和环磷酰胺同时静脉注射的给药剂量分别按照临床治疗的给药剂量进行换算,给药后于0.25、0.5、0.75、1、1.5、2和3h时,耳缘静脉取血。血样经过一系列处理后,通过高效液相色谱仪测定出白消安的血药浓度,数据由DAS 3.0药代动力学软件处理以计算白消安的药代动力学参数。5.环磷酰胺对家兔体内GST活性的影响准备5只健康家兔,分别称重并记录,给药前禁食12h,可自由喂水。先从5只家兔的耳缘静脉取血1mL,用谷胱甘肽硫转移酶测试试剂盒测定家兔血清中GST活性,作为自身对照;环磷酰胺在临床上口服给药剂量是8mg/kg,按照家兔与人的剂量换算系数(3.27mg/kg),环磷酰胺的家兔给药量是26.16mg/kg。根据每只家兔的体重和已配好的药物溶液浓度,算出每只家兔应该给予的药液体积,进行口服灌胃给药,于2h后取血1mL,同样用谷胱甘肽硫转移酶测试试剂盒来测定家兔血清GST活性。6.环磷酰胺对HepG2细胞GST活性的影响取处于对数生长期且状态良好的HepG2细胞,经过传代处理,将均匀的细胞悬液平均分配到各个新的细胞培养瓶中,且调整每个培养瓶细胞浓度为5 × 104/mL,继续培养24h后,分别将适量的环磷酰胺溶液加入到培养液中,使环磷酰胺浓度分别为0、100、200、400、600、800和1000μg/mL,且每个浓度平行做三次,2h后,收集各个培养瓶中的培养液,并测定HePG2细胞的GST活性。结果:1.GSTA1基因多态性的检测根据DNA测序的方法,直接测定了可能发生突变的4个启动子区域的位点(-631,-567,-69,-52)的碱基序列,确定了 170例恶性血液病患者GSTA1的基因分型。结果揭示,基因型GSTA1*A*A(野生型)的频率为75.3%,基因型GSTA1*A*B(杂合突变型)的频率为22.9%,基因型GSTA1*B*B(突变纯合型)的频率是1.8%。等位基因GSTA1*A和*B出现的频率分别是86.8%和13.2%。卡方检验结果表明,不同性别之间的GSTA1基因型分布无显著性差异(p=0.743),即可认为男女之间的GSTA1基因型分布无差别,符合Hardy-Weinberg平衡。2.GSTM1基因多态性的检测根据PCR产物的DNA测序结果,确立了170例血液病患者的GSTM1基因的缺失多态性情况。一共有61例患者出现了GSTM1基因片段缺失的情况,109例患者的GSTM1基因序列完整,GSTM1的基因总体的缺失率为35.9%。93名男性患者中有33例出现GSTM1基因缺失的情况,缺失率为35.5%;77名女性患者中有29例出现GSTM1缺失的情况,缺失率为37.7%。通过卡方检验看出,在不同性别下,GSTM1基因的缺失率没有显著性差异(p=0.796),即可认为男女之间的GSTM1基因缺失率无差别,符合Hardy-Weinberg平衡。3.GST活性的测定根据谷胱甘肽硫转移酶试剂盒,测定了170例恶性血液病患者的GST活性。结果显示,这170例样品的GST活性服从正偏态分布。男性组GST的平均酶活性为5.20±0.13nmol/min/mL,女性组的平均酶活性为5.17±0.12nmol/min/mL,t检验后,得出不同性别之间GST活性的分布无差异。以11-30、31-50、51-70和71-90分为四组,GST活性分别为5.24±0.25nmol/min/mL、5.09±0.17nmol/min/mL、5.18±0.13 nmol/min/mL和5.32±0.27nmol/min/mL,进行最小显著性差异t检验(LSD t-test),不同组别之间相互比较,所有p值均大于0.05,即不同年龄组的GST活性无显著性差异,可以认为不同年龄之间GST活性的分布无差异。4.GSTA1基因多态性对GST活性的影响野生型GSTA1 A/A的平均酶活性为5.34±1.26nmol/min/mL,杂合突变型GSTA1 A/B的平均酶活性为4.83±0.76nmol/min/mL,纯合突变型GSTA1 B/B的平均酶活性为3.23±0.07nmol/min/mL。通过LSD t-test检验,进行不同组别之间的相互比较,结果所有p值均小于0.05,可认为GSTA1不同基因型之间的GST活性存在差异,即不同基因型的酶活性大小顺序为:野生型>杂合突变型>纯合突变型。5.GSTM1基因缺失多态性对GST活性的影响统计170例血样的GST活性和GSTM1基因的缺失情况,结果显示,在62例GSTM1基因缺失的群体中,平均GST活性为5.09±1.24nmol/min/mL,在108例GSTM1基因完整的群体中,平均GST活性为5.23±1.17nmol/min/mL。经过y检验,p=0.424>0.05,揭示出GSTM1基因缺失型(-)和GSTM1非缺失型(+)之间的GST活性无差异,即GSTM1基因片段的缺失与否,不显著影响GST活性。6.同时给予BUCY静注后白消安的药动学研究采用DAS 3.0软件拟合白消安在家兔中的血药浓度,求算出5只家兔体内白消安的药代动力学参数:半衰期t1/2=1.46±0.26(h),曲线下面积AUC=8.097±0.795(h*mg/L),,初始浓度C0=3.907±0.472(mg/L)。对比单独静脉注射白消安的药代动力学参数:半衰期t1/2=1.05±0.153(h),曲线下面积AUC=3.846±0.213(h*mg/L),初始浓度G0=2.463±0.245(mg/L)。结果显示,同时静脉注射环磷酰胺和白消安后,白消安在家兔体内的消除半衰期t1/2变长,初始浓度C0和曲线下面积AUC均较大。7.环磷酰胺对家兔体内GST活性的影响计算出5只家兔经过环磷酰胺预处理前后的平均GST活性分别是6.785±0.9799 nmol/min/mL和13.1468±3.3256nmol/min/mL。通过配对t检验,p=0.012<0.05,即环磷酰胺处理前后,家兔体内GST活性有差异,可以认为,环磷酰胺预处理后,家兔体内的GST活性增强。8.环磷醜胺对HepG2细胞GST活性的影响环磷酰胺浓度分别为0、100、200、400、600、800和1000μg/mL时,所对应的HepG2细胞GST活性分别为2.266±0.050、2.53 0±0.174、3.458±0.187、3.622±0.012、3.691±0.106、3.830±0.116 和 3.941±0.065nmol/min/mL。当环磷酰胺浓度在0-200μg/mL的范围内,对应的HepG2细胞GST活性增大较为明显,当环磷酰胺浓度大于2000μg/mL时,对应的HepG2细胞GST活性基本上不变。结论:1.通过PCR-RFLP反应,,并结合DNA测序的方法,准确、直观、可靠的研究了 170例恶性血液病患者GSTA1和GSTM1的基因多态性情况,同时测定了 170例恶性血液病患者体内的GST活性,发现GSTA1不同基因型的酶活性大小顺序为:野生型(GSTA1 A/A)>杂合突变型(GSTA1 A/B)>纯合突变型(GSTA1 B/B),GSTM1基因缺失型和未缺失型的GST活性无差异,这说明GSTM1基因型不是影响GST活性的主要因素,而GSTA1基因型主导着GST活性,GSTA1野生型对应的GST活性最强,GSTA1杂合突变型对应的GST活性次之,GSTA1纯合突变型对应的GST活性相对最低。这为临床个体化给药的方案设计提供了重要的理论支撑,帮助更好的实现精准治疗。2.当先给予家兔环磷酰胺预处理后,白消安在家兔体内的消除半衰期变短(t1/2 m=1.363±0.24h,t1/2 s=0.867±0.167h,p=0.016),说明环磷酰胺预处理后,白消安在家兔体内的代谢加快,而本实验通过对比环磷酰胺预处理前后家兔和HepG2细胞内GST活性的变化情况,发现GST活性增强,这说明GST确实可被环磷酰胺激活,也证实了白消安在家兔体内代谢加快的结果。然而同时对家兔静脉注射环磷酰胺和白消安后,发现白消安的消除半衰期变长(t1/2BU=1.05±0.153h,t1/2BUCY=1.46±0.26h,p=0.047),这说明同时给药时环磷酰胺和白消安会竞争GST,从而导致白消安代谢减慢。这为临床BUCY给药方案次序上的设计提供了重要的理论依据,可帮助更好的实现精准治疗。