吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone, PQQ)是继烟酰胺核苷酸(NAD、NADP)和核黄素核苷酸(FMN、FAD)后新发现的一种辅助因子,因其具有独特的生物功能近年来受到广泛关注。但是由于对PQQ的代谢通路并不完全清楚,通过基因工程方法进行定向改造存在一定难度。本论文通过以下几种方法对肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae DSM2026进行改造,主要目的是提高吡咯喹啉醌产量。主要分为以下几个方面：1、对本实验室通过紫外诱变、氯化锂诱变、以及紫外-氯化锂复合诱变筛选得到3株高产菌U1,U2和L1进行培养基优化和产量研究。2、本论文对肺炎克雷伯氏菌进行基因组改组(Genome shuffling)的条件进行了考察。通过文献报道结合肺炎克雷伯氏菌的生长特点及细胞结构最终确定肺炎克雷伯氏菌的Genome shuffling条件为,酶解时溶菌酶浓度为0.1mg/mL,37℃酶解1.5-2h,每隔15min摇匀一次。对原生质体灭活条件确定为,热灭活在55℃灭活25min,UV照射5min。原生质体融合条件为0.1mL的高渗溶液加0.1mL的新生磷酸钙溶液加0.8mL的PEG6000,37℃融合5-6min。3、将产量得到提高的3株菌U1,U2和L1作为出发菌株,按上述条件进行Genome shuffling,利用高通量筛选通过3轮Genome shuffling最终从3000多株菌中获得1株高产菌F3-8,通过LB培养基及M9培养基进行发酵,研究其生长情况和PQQ产量,并通过HPLC测得其最高产量达到418mg/L,是出发菌株的5.4倍,原始菌株近10倍。4、利用全局转录机器工程(gTME)的方法,通过易错PCR技术构建K. Pneumoniae RNA聚合酶关键元件rpoD基因的突变文库,并将其与pET-PK载体连接后转化感受态K. pneumoniae,通过高通量筛选方法从1500多个阳性克隆中最终得到一株吡咯喹啉醌(PQQ)高产菌K.p (pET-PK-trpoD)。发酵试验表明,该菌的PQQ产量达到76mg/mL,比对照菌产量提高了10%。通过测序发现rpoD基因在核酸及蛋白质水平的突变率分别达到2.5%和0.5%。二级结构预测发现α螺旋、p转角和无规则卷曲数目均发生了变化,推测由此改变了。因子与启动子的亲和程度,从而导致了PQQ基因的转录以及K.pneumoniae代谢流量再分配,使得PQQ得到更高效表达。5、吡咯喹啉醌合成可能涉4-7个相关基因,K.pneumoniae的PQQ生物合成涉及6个基因即PQQ-ABCDEF,本论文试图通过将这6个基因顺序打乱再重新排布的方法,研究这6个基因的的数量、分布、及基因正反向对PQQ合成的影响,并对实验结果进行了分析。