创伤弧菌快速检测的增菌液和选择性培养基的研制

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目的:⑴制备创伤弧菌增菌液的特殊添加组分-酪酸梭菌细胞壁活性成分。⑵研制一种有利于创伤弧菌快速检测增菌液。⑶在增菌液基础上制备创伤弧菌的选择性增菌培养基。  方法:①创伤弧菌菌株,编号QT689,来源于温州医科大学附属第一医院检验科。复苏培养后,划线接种于哥伦比亚血琼脂平板,观察其菌落形态,行革兰染色,光镜观察,并接种于生化管观察其生化特性。②酪酸梭菌细胞壁活性成分的制备,经过酪酸梭菌菌体浓缩、高压破壁、冷冻减压、干燥、粉碎,得到稳定的可溶性黄白色粉末,即为CWAC。③实验以3%氯化钠碱性蛋白胨水(alkaline peptone water, APW)为基础增菌液,以不同浓度的CWAC、MgCl2、KCl、Na2S2O3为研究对象,通过单因素实验分析四种添加物对创伤弧菌生长的影响。并在此基础上利用响应面法对实验结果进行优化。④在实验的基础上,添加纤维二糖、乳糖、Na2S2O3和多粘菌素B、多粘菌素 E为选择性鉴别培养基的成分,并研究其对纯菌液和混合菌液(创伤弧菌101 CFU/mL,大肠杆菌103 CFU/mL,金黄色葡萄球菌103 CFU/mL)的灵敏性和特异度。  结果:⑴创伤弧菌QT689株在固体培养基上生长为典型粘液(M)型菌落,光镜下为革兰染色阴性弧状菌,生化特性与文献报道一致。⑵得到的CWAC为一种稳定可溶性黄白色粉末,肽聚糖(Peptidoglycan,PG)作为细胞壁的主体,约占细胞壁干重的50-90%。⑶单因素结果显示CWAC、MgCl2、KCl均能促进创伤弧菌的生长,而Na2S2O3对创伤弧菌生长无明显影响,经响应面法分析后得增菌液最优组合为:CWAC量为0.7 g/L(0.07%),MgCl2量为1.2 g/L(0.12%),KCl量为0.2 g/L(0.02%),在该条件下增菌培养基中创伤弧菌培养12 h培养液的OD600nm理论值为1.399,而对照组为0.391。⑷所设计的选择性鉴别培养基,在选择性的抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的同时,能促进创伤弧菌的生长。而该培养基的检测下限可达101 CFU/mL,并在6 h内有效增菌。  结论:①酪酸梭菌细胞壁活性成分,即 CWAC可作为创伤弧菌增菌液的有效添加成分。②改良得到的优化增菌液(0.07%CWAC,0.12%MgCl2, and0.02%KCl)相比于APW能有效起到快速增菌创伤弧菌的作用。③制备得到的创伤弧菌选择性培养基(增菌液加0.6%纤维二糖,0.4%乳糖,0.06% Na2S2O3,100000 IU多粘菌素B和40000 IU多粘菌素E)能选择性促创伤弧菌生长,抑制非目标菌生长。
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