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二化螟是我国水稻产区的螟虫优势种,对水稻生产构成威胁。当前化学防治措施依然是防治二化螟所采用的主要措施,但是不合理及长期使用化学农药,造成了稻田系统生物多样性下降、害虫抗药性增加、水稻安全生产受到威胁等问题,且近年来二化螟发生数量有增无减,故寻找更加安全有效的二化螟防治措施刻不容缓。在田间栽种香根草可以有效吸引二化螟雌蛾在其上产卵,但是,在香根草上二化螟幼虫无法完成生活史,即取食香根草可造成二化螟幼虫死亡,前期研究结果表明这种致死作用与二化螟取食香根草后体内细胞色素P450酶活性降低有关,然而当前该致死机制尚不明确。本文以二化螟为研究对象,在前期转录组分析工作的基础上,从分子水平对二化螟CsCYP6A2、CsCYP30641基因进行了系统研究,分析了二化螟两种细胞色素P450基因发育阶段、组织特异表达及取食香根草对其表达的影响,利用RNA干扰技术研究二化螟CsCYP6A2、CsCYP306A1基因对香根草的解毒代谢机制,取得的主要结果如下:一、二化螟两种细胞色素P450基因的克隆及序列分析本研究通过转录组测序得到二化螟CsCYP6A2和CsCYP306A1基因,克隆得到它们的基因全长序列,对二化螟两种细胞色素P450基因的序列分析结果表明,CsCYP6A2基因序列开发阅读框(ORF)为1518 bp,编码505个氨基酸,预测蛋白分子量58.10 kDa,等电点为8.55。预测到4个细胞色素P450基因的特征序列,包括C螺旋保守序列WxxxR、K螺旋保守序列ExLR、PERF基序PxxFxPE/DR和位于血红素结合区的P450标志序列PFxxGxxxCxG。CsCYP306A1基因序列ORF为1437 bp,编码478个氨基酸,预测蛋白分子量54.78 kDa,等电位为6.58。预测到的细胞色素P450特征序列有C螺旋保守序列WxxxR和I螺旋保守序列GxE/DTT/S。二、二化螟两种细胞色素P450基因的发育阶段表达分析运用荧光定量RCR技术测定了二化螟CsCYP6A2和CsCYP306A1基因在不同发育阶段的表达,发现CsCYP6A2和CsCYP306A1基因在二化螟各个发育阶段均有表达。但是,CsCYP6A2基因在5龄表达量最高,3龄、4龄和6龄次之,在卵阶段、低龄幼虫和成虫期相对表达量较低。CsCYP306A1基因在卵阶段的表达量最高,5龄和雌成虫次之,在雄成虫表达量最低。三、二化螟两种细胞色素P450基因的组织特异表达分析运用Real-timeRCR技术测定了二化螟CsCYP6A2和CsCYP306A1基因在二化螟3龄幼虫的不同组织部位的表达,结果表明:两种细胞色素P450基因在所有组织中都有表达,但表达量高低有所不同,CsCYP6A2基因在脂肪体表达量最高,表皮和中肠此之,头部表达量最低。CsCYP306A1基因在中肠表达量最高,脂肪体和表皮次之,头部表达量最低。四、取食香根草对二化螟两种细胞色素P450基因表达的影响对二化螟取食香根草和水稻不同天数及取食4天后不同组织两种细胞色素P450基因的表达量进行测定,结果显示二化螟取食不同天数中香根草处理组CsCYP6A2基因表达量均低于水稻对照组,且该基因在测定的二化螟各组织中的表达量也表现为香根草处理组均低于水稻对照组,说明香根草中可能存在抑制该基因表达的物质。而CsCYP306A1基因在二化螟开始取食香根草1-2天内,其表达量高于水稻对照组,而后随着饲喂时间延长,其表达量均低于水稻对照组,此外该基因在中肠中的表达量最高,说明该基因可能参与解毒代谢香根草中有毒物质,但随着取食时间延长,该基因的表达受到抑制。五、基于RNAi的二化螟两种细胞色素P450基因功能研究本研究发现在分别注射CsCYP6A2和CsCYP306A1两个细胞色素P450基因dsRNA后,与注射Buffer的对照组相比,dsCYP6A2和dsCYP306A1两个处理组的化蛹率降低。注射dsRNA后的试虫分别饲喂水稻和香根草,死亡率随饲喂时间延长均逐渐增大,且香根草处理组试虫死亡率高于水稻对照组,香根草处理组试虫的中肠和脂肪体内CsCYP6A2和CsCYP306A1基因表达量也显著低于水稻对照组。表明本研究中获得的2个细胞色素P450全长基因涉及二化螟对香根草有毒物质的代谢。综上所述,本研究通过转录组测序获得二化螟两种细胞色素P450基因,并克隆得到CsCYP6A2和CsCYP306A1基因全长序列,为二化螟细胞色素P450基因结构和功能研究奠定了基础;运用Real-time RCR技术分析了 CsCYP6A2和CsCYP306A1基因在二化螟不同发育阶段、不同组织部位的表达特性,也对取食香根草对其表达的影响进行了系统分析,且在RNAi的基础上,探讨了二化螟CsCYP6A2和CsCYP306A1基因在代谢香根草有毒物质中的关系。研究结果为二化螟体内细胞色素P450的生物学功能及生理生化特性的研究发展提供了资料,对于揭开香根草对二化螟具致死机制意义非凡,为二化螟有效绿色防控措施提供了基于细胞色素P450基因研究的科学依据,并对昆虫细胞色素P450的整个研究体系有所贡献。