第一部分CREB1在小鼠OIR模型中的表达变化目的研究环腺苷酸反应成分结合蛋白1(CREB1)在小鼠氧诱导视网膜病变(OIR)模型视网膜新生血管形成中的表达变化,寻找病理性视网膜新生血管形成的可能机制。方法选用7d龄的健康清洁级C57BL/6J小鼠134只,随机分为正常对照组(n=67)和OIR模型组(n=67)。将小鼠与哺乳母鼠共同置于(75±2)%氧环境内饲养5d后转移至正常环境中饲养9d,建立小鼠OIR模型,正常对照组在正常氧环境中饲养21d。出生后第17d时取OIR模型组和正常对照组小鼠制备视网膜切片HE染色法和FITC-dextran心脏灌注视网膜铺片法观察视网膜新生血管情况,以及视网膜组织冰冻切片免疫荧光染色观察P-CREB1表达情况。取2组鼠第7、9、12、14、17、21d的视网膜分别采用实时定量聚合酶链反应(1eal-time PCR)法和Western Blot法检测CREB1mRNA和P-CREB1蛋白在小鼠视网膜中的表达情况。两组相同时间点之间的比较采用独立样本t检验；两组间多时间点的比较采用两因素方差分析方法进行分析,两两差异比较采用Bonferroni post-test检验。结果17d时视网膜切片HE染色显示OIR模型组突破视网膜内界膜的内皮细胞核数明显增加,与正常对照组相比差异有统计学意义(t=11.31,P<0.05),模型组视网膜新生血管区及无灌注区面积分别为(30.61±3.12)%和(21.40±2.72)%。模型组小鼠视网膜中可见大量P-CREB1蛋白荧光主要表达在内核层和神经节细胞层。Real-time PCR和Western Blot结果表明,正常对照组第7、9、12、14、17d时CREB1mRNA和P-CREB1蛋白在视网膜中的表达水平呈逐渐升高,21d时开始出现下降：在各相应时间点OIR模型组里的CREB1相对表达量除第7d时,其余时间均高于正常对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论CREB1的表达水平与视网膜新生血管的形成存在时空对应关系,CREB1的高表达可能参与了氧诱导视网膜病变模型中视网膜新生血管的形成过程。第二部分针对CREB1的siR NA慢病毒载体的构建、鉴定及包装目的：设计、构建及包装针对小鼠CREB1基因的小干扰RNA(siRNA)慢病毒载体,为将来进一步的实验提供实验工具及完善理论依据。方法：1.选用质粒pLenR-GPH Vector作为载体用于构建基因CREB1小干扰RNA表达载体；2.根据NCBI nucleotide CREB1的mRNA序列,设计针对小鼠CREBl基因的2个特异性siRNA靶序列,合成含干扰序列的双链DNA oligo,直接连入酶切后的载体上；3.将连接好的产物转入感受态细胞,挑选阳性克隆做PCR鉴定,鉴定阳性的克隆扩增后提取质粒,进一步做测序鉴定；4.测序比对后,鉴定阳性的克隆即为构建成功的CREB1小干扰RNA慢病毒质粒。5.流式细胞法测定包装后的重组CREB1siRNA慢病毒滴度。结果：成功构建并包装了携带EGFP标签的针对小鼠CREB1基因的siRNA慢病毒载体；重组的CREB1siRNA慢病毒质粒滴度≥1.5×109TU/ml。结论：携带EGFP针对小鼠CREB1目的基因的小干扰RNA序列的慢病毒载体已成功构建及包装,且重组CREB1siRNA慢病毒滴度高,符合动物实验所需,是我们后续研究CREB1基因功能的强有力的实验工具。第三部分慢病毒介导CREB1特异性siRNA对小鼠视网膜新生血管的抑制作用及其机制目的观察玻璃体腔注射慢病毒介导的环腺苷酸反应成分结合蛋白1(CREB1)特异性小干扰RNA (siRNA)对氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠视网膜新生血管的抑制作用。方法将140只5日龄C57BL/6J小鼠均分为正常对照组、氧诱导视网膜病变模型组、空载体组和CREB1干扰组(n=35)。正常对照组小鼠在正常空气中饲养。OIR模型组、空载体组和CREB1干扰组小鼠均按照前面的方法建立OIR模型。OIR模型组不予治疗。空载体组及CREB1干扰组小鼠于出生后5d分别行玻璃体腔注射不含目的基因干扰片段的慢病毒空载体(CREB1-NC-siRNA)和携带目的基因CREB1特异性小干扰RNA的慢病毒载体(CREB1-siRNA)各1.0μl。第12d时荧光显微镜下观察转染情况。第17d时免疫荧光检测磷酸化CREB1的表达,观察CREB1基因的干扰效果。计数突破视网膜内界膜的新生血管内皮细胞核数和荧光血管造影视网膜铺片评价视网膜新生血管情况；计算小鼠视网膜新生血管和无灌注区面积；实时定量聚合酶链反应和蛋白质免疫印迹法检测小鼠视网膜CREB1mRNA和磷酸化CREB1(P-REB1)蛋白表达,以及血管内皮生长因子(VEGF)-A、丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶(Akt)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的mRNA和蛋白表达情况。数据采用单因素方差分析进行比较。结果玻璃体腔注射慢病毒一周后,干扰组和空载体组视网膜内见大量绿色荧光蛋白的表达,而正常对照组和模型组视网膜切片中无绿色荧光蛋白的表达。第17天时免疫荧光检测发现模型组和空载体组中大量P-CREB1荧光蛋白在视网膜内核层和神经节细胞层表达,而CREB1干扰组中荧光蛋白表达明显减少。正常对照组视网膜内核层和神经节细胞层中仅见少量荧光蛋白。突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核计数在干扰组和空载组、模型组间差异均有统计学意义(F=50.48,P<0.01)。荧光血管造影显示正常组视网膜深浅层血管分布均匀,未见血管闭塞、新生血管区及无灌注区。其他三组均可见无血管区及新生血管区。CREB1干扰组新生血管及无灌注区面积明显较OIR模型组和空载组减少(F=110.09, P<0.01; F=67.22, P<0.01); OIR模型组和空载体组间新生血管及无灌注区面积差异无统计学意义(P=0.917；P=0.877)。OIR模型组、空载组小鼠视网膜CREB1mRNA和P-CREB1蛋白表达以及VEGF-A、Akt、PI3K mRNA和蛋白表达均较正常对照组明显增加；CREB1干扰组小鼠视网膜CREB1mRNA和P-CREB1蛋白表达以及VEGF-A、Akt、 PI3K、mRNA和蛋白表达较OIR模型组、空载组明显下降。4组小鼠视网膜CREB1、VEGF-A, Akt、PI3K mRNA表达比较,差异均有统计学意义(F=6.087、5.464,6.191、8.627,P<0.05)。4组小鼠视网膜P-CREB1、VEGF-A、Akt、PI3K蛋白表达比较,差异也有统计学意义(F=162.944、13.861、19.710、22.827, P<0.05)。结论玻璃体腔注射慢病毒介导的CREB1siRNA转染视网膜可有效抑制氧诱导小鼠视网膜新生血管的形成,其作用可能与下调PI3K/Akt及VEGF-A的作用有关。