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蛋白质组学样品制备过程中,溶液酶解法存在酶时间长、自降解、低效率等问题。本论文尝试通过将酶固定在聚(异丙基丙烯酰胺-co-丙烯酸)[P(NIPAM-co-AAc)]微球上,以期克服溶液酶解法存在的上述问题。首先,采用膜乳化法制备了尺寸均一、大小可控的不同丙烯酸含量的P(NIPAM-co-AAc)微球,然后对微球进行了表征,最后将胰蛋白酶固定在微球上并将载酶微球用于酶解模型蛋白,结果如下:
1)使用膜乳化法,以环己烷和氯仿混合溶液为油相,得到均一乳液液滴,然后在室温条件下通过外加四甲基二乙胺(TEMED)引发聚合反应,制备了一系列不同丙烯酸含量尺寸均一的P(NIPAM-co-AAc)微球。结果表明,在压力2 kPa,环己烷氯仿体积配比7:3,第一阶段过膜搅拌速度140 r/min,第二阶段反应搅拌速度170 r/min的条件下,可以制备粒径均一,大小可控,重复性较好的P(NIPAM-co-AAc)微球。激光粒度仪表征结果显示,其20℃水溶液中其平均粒径为20μm,CV值21.6％。
2)对P(NIPAM-co-AAc)微球的最低临界溶解温度(LCST),进行了表征。结果显示,随着丙烯酸含量在P(NIPAM-co-AAc)微球中逐渐增加,LCST逐渐减小；随着pH的提高,微球的LCST逐渐增大,转变温度范围变宽。电导滴定结果显示,所有不同丙烯酸含量的P(NIPAM-co-AAc)微球电导滴定曲线均为4阶梯形状:随着丙烯酸含量的增加,微球外层和内层包埋羧基含量逐渐增加,但是外层羧基占总羧基含量的百分比呈现先增大,然后趋于不变的趋势,在丙烯酸为15％达到相对最大值。
3)使用真空、冷冻干燥、超临界干燥法对得到的P(NIPAM-co-AAc)微球进行干燥。结果显示,三种干燥方法中,只有超临界干燥法可以有效保护微球球形及其表面形貌。SEM、CLSM和孔隙度测量结果显示,在不加丙烯酸的PNIPAM微球内部存在大量的大孔,在不同丙烯酸含量P(NIPAM-co-AAc)微球内部存在大量2 nm-50 nm的狭缝孔。研究表明,随着丙烯酸含量的增加,微球内部介孔和微孔百分比逐渐增大,而大孔百分比逐渐减小,这导致微球内部平均孔径、比表面积呈现随丙烯酸含量提高而减小的趋势。
4)将丙烯酸含量7.5％P(NIPAM-co-AAc)微球用于胰蛋白酶固定,并将载酶微球用于模型蛋白酶解。结果显示,当酶浓度固定为2.7 mg/ml时,在pH5.5和25℃条件下,反应时间为2 hr,碳二亚胺(EDC)浓度为0.45 mg/ml时,酶固载量和活性回收率分别达到615 mg/g和81.2％的相对最优值。对固定化胰蛋白酶储存稳定性考查结果显示,4℃条件下,30天内酶活保留率达98％。当酶与底物BSA比例为1:50时,总离子流量图结果显示,自由胰蛋白酶和固定化酶均可很好地酶解BSA。匹配度搜索结果显示,两者均成功鉴别出BSA。当固定化胰蛋白酶与BSA比例为1:25时,仍然可以有效鉴别BSA,表明固定化胰蛋白酶可以有效降低胰蛋白酶自解,而文献报道游离胰蛋白酶在这个比例下由于酶自解严重,已经无法有效鉴别模型蛋白,这一结果使进一步提高酶浓度,缩短酶解时间成为可能。