目的近年来中医中药在肿瘤治疗方面表现出了卓越的优势,中药具有多靶点、多效性的特点,在改善放疗敏感性方面有其自身的特点,现已有许多中药提高肿瘤放射敏感性的报道。本项目拟从肝癌这一多发肿瘤入手,观察苦参碱作用于人肝癌HepG2细胞后细胞的生长抑制情况和苦参碱联合放射对肝癌周期凋亡情况及细胞中MUC-1蛋白表达情况的变化,探索相应变化的机制。研究方法第一部分,研究苦参碱对人肝癌HepG2细胞的生长增殖的影响,应用不同浓度(0.0mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.6mg/ml)的苦参碱处理人肝癌HepG2细胞,分别培养不同时间(24H、48H、72H)后,收集细胞,用CCK8增殖实验法检测苦参碱对人肝癌HepG2细胞的增殖抑制效果。第二部分,研究苦参碱对人肝癌HepG2细胞的放疗增敏作用。1.通过联合应用一定浓度的苦参碱和放疗作用于人肝癌HepG2细胞,检测各组细胞凋亡情况及细胞周期分布变化,具体是将人肝癌HepG2细胞分4组,分别是空白对照组、苦参碱组、照射组和照射+苦参碱组,采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测肝癌细胞凋亡情况和细胞周期分布情况,判断苦参碱对肝癌细胞的早期晚期凋亡和细胞各周期有无影响;2.通过联合应用一定浓度的苦参碱和放疗作用于人肝癌HepG2细胞,继续培养48H和72H,采用蛋白免疫印迹法(WB法)检测苦参碱和放疗作用前后细胞中MUC-1蛋白的变化,使用实时荧光定量PCR法(RT-PCR法)分析苦参碱和放射对细胞中MUC-1 mRNA的表达情况,判断苦参碱对肝癌细胞中MUC-1蛋白有无影响。研究结果第一部分,研究苦参碱对人肝癌HepG2细胞的生长增殖的影响,结果显示CCK-8法发现经苦参碱作用后的人肝癌HepG2细胞,其细胞生长抑制率高于对照组;苦参碱作用时间越长的组别比作用时间短的组别抑制率高,苦参碱药物浓度越高的组别比苦参碱药物浓度低的组别抑制率高差异具有统计学意义(P<0.05)。说明苦参碱可以抑制人肝癌HepG2细胞的生长增殖,而且作用效果呈时间-剂量相关性。第二部分,研究苦参碱对人肝癌HepG2细胞的放疗增敏作用,实验结果显示:1.Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞周期分布结果,因G2/M期细胞放射敏感性最强,S期细胞次之,故主要比较G2/M期和S期细胞比例。细胞用含低细胞毒性的苦参碱(0.2mg/ml)培养液处理人肝癌HepG2细胞48H后,流式细胞术检测细胞周期结果显示:对比苦参碱组和空白对照组,发现苦参碱组的G2/M期细胞比对照组的G2/M期细胞稍增多,但统计结果无明显差异(P>0.05),这两组的S期细胞差异P=0.478(P>0.05),差距也无显著性。对比照射组和空白对照组,发现照射组的G2/M期比对照组的G2/M期稍增多,P=0.026,统计结果有差异(P<0.05),S期则无明显差异。对比照射+苦参碱组和空白对照组,苦参碱+照射组的S期细胞稍增多,但统计学上无明显差异(P>0.05)。对比照射+苦参碱组和单纯照射组,发现照射+苦参碱组的G2/M期细胞稍减少,S期稍增多,差异有统计学意义(P<0.05),故从最不敏感的G0/G1期来比较,G0/G1期差异无统计学意义(P=0.344),说明细胞周期无明显变化。对比照射+苦参碱组与单纯苦参碱组,G2/M期、S期和G0/G1期的细胞分布率都无明显差异(P>0.05)。说明苦参碱对于肝癌细胞的周期分布无明显影响。2.流式细胞术检测细胞凋亡情况结果显示,对比照射组和空白对照组的早期晚期凋亡率,照射组的早期晚期凋亡率均有所增加,正常活细胞数量减少(P<0.005),说明放射线可以诱导肝癌细胞的凋亡;对比苦参碱组和空白对照组、单纯照射组和照射+苦参碱组,在苦参碱(0.2mg/ml)作用人肝癌HepG2细胞后,其早期凋亡率和晚期凋亡率均显著增加,正常活细胞数量进一步减少,差异具有显著的统计学差异(P<0.001),说明苦参碱可以诱导肝癌细胞凋亡;对比苦参碱组和照射+苦参碱组,照射+苦参碱组的凋亡率高于单纯的苦参碱组(P<0.001),说明苦参碱可协同放射线进一步诱导肿瘤细胞发生细胞凋亡。3.Western Blot法(蛋白免疫印迹法)检测MUC-1蛋白的表达情况结果显示,对比照射组和空白对照组,发现照射组的MUC-1蛋白的表达量高于空白对照组(P<0.001),说明放射线会引起肝癌细胞中MUC-1蛋白的升高,对比48H和72H两个不同培养时间的表达量来看,72H的表达量高于48H的表达量。对比苦参碱组和空白对照组,发现苦参碱作用于人肝癌HepG2细胞后MUC-1蛋白的表达量降低,说明苦参碱会使肝癌细胞中MUC-1蛋白表达量降低;对比48H和72H两个不同培养时间的表达量来看,72H培养时间的MUC-1蛋白表达量更低,说明苦参碱抑制MUC-1蛋白表达的能力具有时间依赖性,时间越长,其抑制能力越强,其结果具有统计学意义(P<0.001);对比苦参碱和空白对照组、照射和照射+苦参碱组,发现在苦参碱作用人肝癌HepG2细胞后,MUC-1蛋白量更低;对比苦参碱组和照射+苦参碱组,发现照射+苦参碱组的MUC-1蛋白量更低,说明苦参碱能单独抑制人肝癌HepG2细胞中MUC-1蛋白的表达,而当苦参碱与放射线联合应用,则能进一步抑制人肝癌HepG2细胞中MUC-1蛋白的表达(P<0.001),说明苦参碱可以协同放射线进一步抑制人肝癌HepG2细胞中MUC-1蛋白的表达。4.RT-PCR法检测MUC-1 mRNA的表达情况结果可知,对比照射组和空白对照组,发现照射组的MUC-1 mRNA的表达量高于空白对照组(P<0.001),说明放射线会引起肝癌细胞中MUC-1 mRNA的升高,对比48H和72H两个不同培养时间的表达量来看,72H的表达量高于48H的表达量。对比苦参碱组和空白对照组,发现苦参碱作用于人肝癌HepG2细胞后MUC-1mRNA的表达量降低,说明苦参碱会使肝癌细胞中MUC-1 mRNA表达量降低;对比48H和72H两个不同培养时间的表达量来看,72H培养时间的MUC-1mRNA量更低,说明苦参碱抑制MUC-1mRNA表达的能力具有时间依赖性,时间越长,其抑制能力越强,其结果具有统计学意义(P<0.001);对比苦参碱和空白对照组、照射和照射+苦参碱组,发现在苦参碱作用人肝癌HepG2细胞后,MUC-1mRNA量更低;对比苦参碱组和照射+苦参碱组,发现照射+苦参碱组的MUC-1mRNA量更低,说明苦参碱能单独抑制人肝癌HepG2细胞中MUC-1mRNA的表达,而当苦参碱与放射线联合应用,则能进一步抑制人肝癌HepG2细胞中MUC-1 mRNA的表达(P<0.001),说明苦参碱可以协同放射线进一步抑制人肝癌HepG2细胞中MUC-1 mRNA的表达。其各分组表达MUC-1 mRNA的趋势与WB法检测MUC-1蛋白表达的趋势相似,结果与WB法检测MUC-1蛋白的表达结果相一致。结论:1、苦参碱可抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡;2、苦参碱联合放疗对人肝癌HepG2细胞的增殖抑制和凋亡作用明显高于单独苦参碱或单独放疗;3、苦参碱对人肝癌HepG2细胞具有放射增敏作用,其机制可能与抑制HepG2肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡和降低人肝癌HepG2细胞中MUC-1蛋白、MUC-1mRNA表达有关,与调节细胞周期再分布可能无关系。这些研究结果表明苦参碱可以作为肝癌放疗的增敏药物,也为苦参碱的深入研究提供了实验基础和理论依据。创新点:尝试了一种新的中药提取物来探究能否作为肿瘤的放疗增敏剂,目前苦参碱对放疗起增敏作用偶见于临床报道,尚无实验验证及苦参碱增敏作用机制研究。本实验探讨了苦参碱联合放疗抑制肝癌细胞增殖的可能机制:诱导细胞凋亡和抑制MUC-1的表达,对临床治疗有一定的指导意义。